基于公共数据库分析脯氨酸羟化酶3在非小细胞肺癌中的表达及预后价值

秦远，黄丹丹，付彬玉，罗杨坤

610041成都，四川省肿瘤医院·研究所，四川省癌症防治中心，电子科技大学医学院 放疗中心

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer ，NSCLC)是肺癌最常见的组织学类型，可进一步分为鳞癌、腺癌和大细胞癌，约占所有肺癌病例的80%～85%[1]。近年来NSCLC发病率不断增高，是癌症致死率最高的肿瘤，约75%患者发现时已处于中晚期，预后较差[2]。目前NSCLC治疗决策及预后预测主要依靠的是以解剖信息为基础的TNM分期系统[3]。寻找能够反映肿瘤生物学特征的分子标记可能会更好地进行预后判断从而提高NSCLC的生存率。缺氧是肺癌常见的生物学特征，诱导缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)表达的增加。高表达HIF与肿瘤的恶性程度、治疗抵抗和较差预后相关[4-5]。而HIF的稳定性是由脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylase，PHD) 紧密调节，该酶属于双加氧酶超家族成员，分为PHDl、PHD2和PHD3亚型，羟基化HIF的2个脯氨酸残基，是HIF氧依赖性降解的关键酶[6]。其中PHD3受缺氧诱导表达最强，且在缺氧状态下仍能保持其酶活性[7]。既往研究显示PHD3(又名egl-9 family hypoxia inducible factor 3,EGLN3)在多种肿瘤中异常表达，在抑制肿瘤生长及促进肿瘤细胞凋亡中具有重要作用且与预后相关[4, 8-10]。但仅有很少的研究探索了PHD3在NSCLC中的预后价值[11-12]。本研究利用ONCOMINE和GEO (Gene Expression Omnibus)数据库分析PHD3在NSCLC组织中的表达情况，并使用KaplanMeier Plotter和SurvExpress数据库来探索其预后价值。

1 材料与方法

1.1 Oncomine 数据库

ONCOMINE基因表达阵列数据库 (www.oncomine.org), 是一个在线的癌症微阵列数据库以及数据挖掘平台。在本研究中此数据库被用来分析PHD3 mRNA在NSCLC肿瘤及正常组织中的表达水平[13]，应用Students’t-test 分析PHD3 mRNA两者间的表达差异。临界值设定：P值为0.01；倍数变化为2。结果采用柱状图表示。

1.2 GEO 数据库

为研究PHD3 mRNA表达与NSCLC临床病理参数的关系，本研究从GEO数据库中下载了表达谱和相应的临床信息。GSE41271包含275个病例，其中腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)183例，鳞癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)80例，删除分期不明及无随访数据各1例，共有261例患者纳入本研究。病例由PHD3 mRNA中位表达水平分为高低两组，组间表达水平差异由卡方或t检验进行分析。统计采用SPSS 22.0软件包，双侧P<0.05认为差异有统计学意义。图像用GraphPad软件绘制。

1.3 Kaplan-Meier Plotter(KM plotter)数据库

PHD3的预后价值由KM plotter数据库(www.kmplot.com)进行分析，该数据库包含了基因表达和临床数据，可分析54 675个基因对预后的影响，共有10 461例癌症标本，其中包含了中位随访期为49个月的2 437例NSCLC[14]。PHD3按中位表达值分为高和低两组，采用Kaplan-Meier分析，相应P值、风险比(hazard ratio，HR)以及95%置信区间(confidence intervals，CI) 计算并被显示在网页上。Affymetrix探针集(219232_s_at)是PHD3的一个JetSet 探针集，被选择产生Kaplan-Meier图。

1.4 SurvExpress数据库

SurvExpress数据库是一个基因表达数据库和在线标志物验证工具，使用标志物基因作为输入条件提供危险评估和生存分析[15]。本研究对The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库中包含mRNA表达和临床资料的650例NSCLC病例(LUAD 475例，LUSC 175例)进行COX回归分析。将PHD3输入该数据库分析，参数设置：使用原始分数归一化数据；多探针集采用最大行平均数；截尾数值为存活时间(天)。

2 结 果

2.1 PHD3 mRNA 在NSCLC中的表达水平

Oncomine数据库中共有10项研究分析了PHD3 mRNA在NSCLC肿瘤组织和正常组织中的表达水平。荟萃10项研究结果显示，与正常组织相比，PHD3 mRNA在肿瘤组织中高表达(P=0.028，图1)。两种病理亚型按临界值设定的分析结果显示，LUAD(Okayama，Su，Hou 数据集)和LUSC(Garber和 Hou 数据集)中PHD3 mRNA表达水平相对于正常组织均显著增高(图2A-E)。

图1 Oncomine数据库中PHD3在NSCLC中的表达

Figure 1. Expression of PHD3 in Non-Small Cell Lung Cancer(Oncomine Database)

图2 Oncomine数据库中PHD3在LUAD和LUSC中的表达

Figure 2. Expression of PHD3 in Lung Adenocarcinoma and Lung Squamous Cell Carcinoma (Oncomine Database)

2.2 PHD3 mRNA表达与NSCLC临床病理参数的关系

本研究分析了GSE41271数据集中PHD3 mRNA表达与年龄、性别、种族、吸烟史、临床分期、组织学类型等临床病理参数的关系(表1)。

表1 PHD3 mRNA表达与NSCLC临床病理参数的关系

Table 1. PHD3 mRNA Expression and Clinicopathological Parameters in Patients with Non-Small Cell Lung Cancer

ParametersNPHD3ExpressionLow(%)High(%)χ2PAge1.0870.297 ≤64(year)13373(54.89)60(45.11) >64(year)12862(48.44)66(51.56)Gender3.8860.049 Male14165(46.10)76(53.90) Female12070(58.33)50(41.67)Race3.0310.082 Caucasian231115(49.78)116(50.21) Non-caucasian3020(66.67)10(33.33)Smoking4.8730.087 Non2518(72.00)7(28.00) Yes233116(49.79)117(50.21)Miss31(33.33)2(66.67)Histology14.925<0.001 LUAD181108(59.67)73(40.33) LUSC8027(33.75)53(66.25)FinalStage15.1830.001 ⅠA～ⅠB13284(63.64)48(36.36) ⅡA～ⅡB4518(40.00)27(60.00) Ⅲ～Ⅳ8433(40.74)51(60.71)

PHD3: prolyl hydroxylase 3; LUAD: lung adenocarcinoma; LUSC: lung squamous cell carcinoma

结果显示PHD3 mRNA在两种病理亚型及临床分期中表达显著不同(P<0.001，P=0.001；图3A、3B)。以PHD3 mRNA表达的中位值将患者分为两组进一步分析显示，PHD3在男性(P=0.049)；临床分期为Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ期(P=0.001)以及LUSC亚型(P<0.001)的患者中表达增高；但在不同年龄，种族以及吸烟史组中无显著差异。将性别、病理类型及临床分期纳入多因素Logistic回归分析显示：PHD3 mRNA表达与临床分期(P=0.001)及病理类型(P<0.001)显著相关，而与性别(P=0.222)无显著相关性。

图3 GSE41271数据集中PHD3在不同病理类型及临床分期中的表达(A：病理类型；B：临床分期 )

Figure 3. PHD3 Expression of in Different Pathological Types and Clinical Stages (GSE41271 Dataset)(A:Pathological Types; B: Clinical Stages)

2.3 PHD3 mRNA表达水平与NSCLC预后的关系

本研究应用KM plotter数据库分析PHD3 mRNA表达水平与NSCLC患者总生存率(overall survival, OS)的关系。分别有NSCLC患者(n=1 726，图4A)，LUAD患者(n=591，图4B)，LUSC患者(n=492，图4C) 纳入分析。结果显示PHD3 mRNA表达水平显著影响NSCLC和LUAD患者的OS (HR1.25,95%CI1.1～1.4,P<0.001；HR1.45,95%CI1.14～1.86,P=0.003)。高表达PHD3 mRNA患者的预后明显低于低表达患者。而PHD3 mRNA表达水平对LUSC患者的预后无影响(HR1.15,95%CI0.9～1.47,P=0.260)。

本研究应用SurvExpress数据库进一步分析PHD3 mRNA表达水平与NSCLC患者的预后危险因素和累积生存的关系。该数据库以PHD3 mRNA表达水平为风险因素计算预后指数，用于生成风险组别(高风险和低风险组)。本研究中风险组别的样本是以平分的形式进行分析。对475例LUAD(LUAD-TCGA-lung adenocarcinoma dataset June 2016)的分析结果显示PHD3 mRNA高表达与较差的生存显著相关(P=0.013，图5A)，在高风险组中其表达显著上调(P<0.001，图5B)。而对175例LUSC(LUAD-TCGA-lung squamous cell carcinoma dataset June 2016)的分析结果显示，尽管PHD3 mRNA在高风险组中显著下调(P<0.001，图6B)，但与预后无相关性(P=0.724，图6A)。

图4 Kaplan-Meier Plotter 数据库分析PHD3 mRNA对NSCLC患者总生存率的影响(A：NSCLC；B：LUAD；C：LUSC)

Figure 4. Effect of PHD3 mRNA on the Overall Survival of NSCLC Patients Generated from Kaplan-Meier Plotter(A: NSCLC; B: LUAD; C: LUSC)

图5 SurvExpress数据库分析PHD3 mRNA对LUAD患者预后的影响(A：生存曲线；B：不同风险组基因表达水平)

Figure 5. Effect of PHD3 mRNA on the Prognosis of Lung Adenocarcinoma Patients Generated from SurvExpress(A:Survival Curves; B: Gene Expression in Different Risk Groups)

图6 SurvExpress数据库分析PHD3 mRNA对LUSC患者预后的影响(A：生存曲线；B：不同风险组基因表达水平)

Figure 6. Effect of PHD3 mRNA on the Prognosis of Lung Squamous Cell Carcinoma Patients Generated from SurvExpress(A:Survival Curves; B: Gene Expression in Different Risk Groups)

3 讨 论

本研究应用四个公共数据库对PHD3 mRNA在NSCLC中的表达水平以及预后价值进行挖掘分析，结果显示与正常组织相比，肿瘤组织中PHD3 mRNA表达水平明显增高。高表达PHD3 mRNA提示NSCLC患者具有较差的预后。本研究还发现PHD3 mRNA表达水平与LUSC预后呈显著负相关，但与LUSC的预后无相关性。因此本研究提示PHD3的表达水平可以作为LUAD预后的一个潜在生物学指标。

PHD3是PHD家族的一员，包含两个羟化酶单位及两个蛋白二硫化物异构酶亚单位，可羟基化HIF分子中特定的脯氨酸残基，进而通过泛素连接酶-蛋白酶途径降解HIF[6]。PHD3不仅是肿瘤组织中氧分压的感受器，还受其他应激相关机制如生长因子剥脱的调节，这些特征使得PHD3成为肿瘤微环境的一个关键压力感受器[16]。PHD3还具有不依赖于HIF的生物学功能，如调节细胞形态，抑制肿瘤细胞生长、分化、转移及在缺氧条件下促进肿瘤细胞凋亡[17]。既往研究显示PHD3在多种肿瘤中存在异常表达。本研究结果显示PHD3 mRNA在NSCLC肿瘤组织中呈高表达，与既往研究结果一致[11, 18]。PHD3表达与临床病理参数的研究结果存在着不一致：Giatromanolaki 等[19]分析结果显示LUSC中PHD3表达增高；Andersen等[11]结果提示PHD3表达与临床病理参数无相关性；Chen等[18]发现在较早临床分期及分化较好的患者PHD3中高表达。本研究结果显示PHD3 mRNA高表达与LUSC亚型，较晚的临床分期相关。PHD3表达检测水平(蛋白水平和mRNA水平)的不同可能会导致结果不一致。另外，本研究的组间分布不均(LUAD及早期临床分期占多数)及样本量偏少也可能影响结果。PHD3表达受到多种因素调节：如神经生长因子[16]，细胞间营养状态[6]，HIF多态性[19]，PHD3甲基化[12, 20]；另外，肺癌是一个高度异质性肿瘤，常伴随着不同的分子表型和临床特征[21-22]。因此PHD3的多因素调节以及肿瘤的异质性特征使其表达呈现复杂性。未来应进一步扩大样本量研究PHD3表达与NSCLC临床病理特征的关系。

关于PHD3在NSCLC中的预后价值，既往研究结果不一；Dopeso等[12]研究显示，由于启动子甲基化沉默PHD3基因，导致PHD3 mRNA低表达，与LUSC较差的OS相关。而另一项基于免疫组化的研究结果显示高表达PHD3提示较差的疾病特异性生存率[11]。本研究结果显示高表达PHD3 mRNA与NSCLC较差的OS相关，与后一个研究结果相似[11]。本研究还对PHD3在NSCLC的两种主要亚型中的预后价值进行了分析。对于LUAD，两个生存数据库分析结果均显示PHD3 mRNA表达增高提示较差的预后，提示PHD3发挥癌基因的作用，与蛋白水平的研究结果相似[11]。对于LUSC，本研究发现PHD3 mRNA表达水平与预后无相关性。尽管在高危险组中PHD3表达显著降低，但PHD3不能将高危险组预后差的患者从总体患者中鉴别出来，与既往PHD3是抑癌基因的研究观点不一致[4, 8-10]。本研究推测原因可能与LUSC数据集样本含量偏少有关。未来应该扩大样本量进一步分析PHD3在LUSC中的预后价值。另外本研究只针对mRNA水平进行了分析，未对蛋白水平进行分析，而且本研究是基于公共数据库的数据挖掘分析，尚需独立数据集的验证，也缺乏对相关分子生物学机制的基础研究，因此仍需更多基于PHD3表达与NSCLC预后的研究进一步验证两者关系。

综上，本研究深入分析了PHD3 mRNA在NSCLC中的表达水平以及预后价值，提示PHD3 mRNA在NSCLC肿瘤中呈高表达,与NSCLC尤其是LUAD亚型的预后显著相关。PHD3表达可以作为反映LUAD预后的生物学指标。本研究结果为探索PHD3在肺癌中的研究提供了基础，为预测患者的预后，鉴定高危患者进行个体化治疗以及发展潜在的靶向药物提供了理论依据。

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