与α-烯醇化酶相关的ELISA方法的建立及在肝纤维化检测中的应用探索

王 波，杨婷婷，李 志

(大连市中心医院检验科，辽宁大连 116033)

肝纤维化是由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生按严重程度，分为早期阶段(肝纤维化期阶段)和晚期阶段(肝硬化期)，肝硬化是由各种因素导致慢性肝损害的一类晚期肝纤维化疾病[1]。肝纤维化期是可逆阶段，如果能早期诊断并给予抗纤维化治疗，肝脏功能可能恢复到正常或接近正常状态，可预防肝硬化的发生[2]。α-烯醇化酶是一种可以在肝纤维化患者体内诱发自身免疫应答的自身抗原，通过原癌基因c-myc的抑制作用来调整细胞生长和分化[3]。国外有研究证实抗α-烯醇化酶的自身抗体在肝纤维化期阶段患者的血清中出现频率相当高，可以作为一种潜在的预测因子[4]。本研究通过原核表达技术获取人α-烯醇化酶，建立酶联免疫吸附试验(ELISA)反应模式检测肝纤维化期和肝硬化患者及健康者血清中抗α-烯醇化酶的自身抗体，评价α-烯醇化酶对肝纤维化的早期诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集处于肝纤维化期阶段(0～3期)的患者35例，肝硬化患者48例，肝纤维化的组织病理学分期采用METAVIR评分系统；另选取本院体检健康者60例作为健康对照组，无免疫性及明显的肝炎疾病证据。对照组与患者组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2菌株与试剂 克隆载体pEASY-T1 Simple Cloning Vector、表达感受态菌BL21(DE3) 等购于北京全式金生物公司；ENO1 cDNA，ENO1抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司；2×Taq PCR Mastermix购于北京天根生化科技有限公司；凝胶成像仪为UVPINC公司产品；包被液、酶标抗人Ig-G为惠民生物技术公司产品；酶标仪为Thermo Fisher公司产品。

1.3实验方法

1.3.1ENO1基因的克隆及表达 根据GenBank中ENO1的cDNA基因序列，设计其中的ENO1基因特异性引物，上、下游引物分别为P1：5′-CGG ATC CAT GTC TAT TCT CAA GAT CCA TGC C-3′，P2：5′-CAA GCT TTT ACT TGG CCA AGG GG-3′；PCR扩增目的基因ENO1；目的片段回收后与克隆载体pEASY-T1连接，转化至Trans-T1感受态细胞后，涂布于Amp/LB平板上，筛选阳性克隆提取质粒。将测序正确的克隆质粒和pET32a(+)表达质粒分别经BamHI/HindⅢ双酶切，切胶回收目的片段，T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接后转化至Trans-T1感受态细胞，于Amp/LB平板上挑取单个克隆培养后提取质粒进行双酶切鉴定；将鉴定正确的重组表达质粒分别转化到感受态菌株BL21(DE3)中，经筛选和增菌后用微生物总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，SDS-PAGE电泳分析表达产物，回收纯化重组蛋白并定量分析，保存于-20 ℃冰箱备用。

1.3.2ELISA方法的建立 利用方阵滴定法确定抗原包被浓度、血清稀释度和作用时间等反应参数，阳性反应的cut-off值是健康混合血清加3个标准差的平均光密度值，最终确定包被抗原浓度为5 μg/mL，血清稀释度为1∶50时，P/N相差较大为最佳稀释浓度。

1.3.3用所建立的ELISA 方法进行标本的检测 (1)包被抗原：用磷酸盐缓冲液PBS稀释ENO1抗原(原浓度为230 μg/mL)浓度至5 μg/mL，100微升/孔，4 ℃过夜，洗液(PBS+0.05%吐温20)冲洗3次；(2)封闭：封闭液(PBS+1%BSA+0.1%吐温20)室温封闭2 h，洗板3次；(3)加待测抗体：将肝纤维化早期患者、肝硬化期患者及健康对照组血清分别稀释后加入封闭后的酶标板100微升/孔，每孔设置平行对照；(4)加二抗：每孔加辣根过氧化物酶标记抗人Ig-G 100 μL,水浴40 min；(5)每孔加终止液TMB 100 μL终止反应，水浴显色15 min后测定OD值。

1.4应用免疫印迹法分析验证ELISA 对肝纤维化期血清标本的抗α-烯醇化酶的自身抗体进行免疫印迹分析，对免疫印迹结果和ELISA结果进行分析，验证2种方法阳性检出率是否相等。

1.5统计学处理 数据分析应用SPSS19.0系统，阳性率比较采用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1ENO1基因的克隆及表达 通过PCR扩增目的基因ENO1，扩增产物大小约为 1 300 bp，与预期结果相符(见图1)。重组表达质粒pET-32a(+)/ENO1经IPTG诱导后，蛋白主要以可溶性上清形式存在，纯化后电泳显示为单一蛋白条带：蛋白ENO1理论值47×103(连接pET-32a载体包含硫氧还蛋白Trx和HIS-tag标签约20×103，故重组蛋白67×103左右)，见图2。

注：M为DNA marker，1为ENO1基因扩增片段

图1ENO1基因PCR产物电泳图

注：M为蛋白质标准，1为纯化后ENO1

图2纯化蛋白SDS电泳图

2.2临床标本的检测 用所建立的ELISA方法检测肝纤维化期患者、肝硬化期患者及健康对照组血清中抗α-烯醇化酶自身抗体，结果显示在肝纤维化期和肝硬化期患者中，抗α-烯醇化酶自身抗体的阳性率高于健康对照组，差异有统计学意义(χ2=8.74,P<0.05)，且在肝纤维化期患者中也显著高于肝硬化期患者，差异有统计学意义(χ2=4.27,P<0.05)，见表1。

表1 各组外周血中抗α-烯醇化酶自身抗体结果

注：与健康对照组比较，*P<0.05；与肝硬化组比较，▲P<0.05

2.3免疫印迹法分析验证ELISA结果 对35例肝纤维化期患者血清α-烯醇化酶进行免疫印迹分析，证实了酶联免疫法和免疫印迹法2种检测方法检出率的一致性(χ2=0.33,P>0.05)，在酶联免疫方法中抗α-烯醇化酶阳性的血清在免疫印迹法中也可得到证实，见表2。

表2 ELISA和免疫印迹法阳性率验证结果(n)

3 讨 论

肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化发展的共同病理学过程，普遍认为肝纤维化的过程是可逆的，适当有效的治疗不仅可减缓其向肝硬化的发展，甚至可减轻已有的肝纤维化程度[5]。因此阻止病情进展到肝硬化期，这有赖于对肝纤维化期阶段的预测和诊断[6-7]。

α-烯醇化酶是一种可以在肝纤维化患者体内诱发自身免疫应答的自身抗原，也是肝纤维化诊断的一种潜在的预测因素[4]。本研究表明可以通过原核表达技术获取人源化的α-烯醇化酶，该蛋白是一种稳定的亲水性蛋白质，以此作为抗原，建立血清学诊断模式，用所建立的ELISA方法检测肝纤维化期患者、肝硬化期患者及健康对照组血清中抗α-烯醇化酶自身抗体，结果显示在肝纤维化期和肝硬化期患者血清中，抗α-烯醇化酶自身抗体的阳性率高于健康对照组(P<0.05)，且在纤维化期患者中也显著高于肝硬化期患者(P<0.05)。有研究表明，在自身免疫性肝炎的患者血清中抗α-烯醇化酶抗体的阳性率(50%～60%)，高于原发性胆汁性肝硬化(30%)和肝癌(14.3%)[4,8]。可以看出，随着肝脏疾病的进展，抗α-烯醇化酶抗体水平呈降低的趋势，尽管现在缺少这种抗α-烯醇化酶抗体从良性肝脏疾病到末期疾病过程中水平变化的全面研究，但是检测抗α-烯醇化酶抗体水平从肝纤维前期到肝硬化再到肝癌的变化表明抗α-烯醇化酶抗体的出现或许是肝脏疾病诊断的预示性标志物，也可以作为肝纤维化期的生物标志物。

尽管抗α-烯醇化酶抗体在肝纤维化形成过程中的发挥机制还不清楚，但有研究报道这种酶可以使纤维蛋白溶酶原结合在细胞表面，也可促使单核细胞在急性肺损伤时移向炎症区域[9]。此外，据报道α-烯醇化酶可以被JNK信号(在纤维化中起积极作用)途径调控[7]。因此α-烯醇化酶在促进免疫细胞趋向炎性反应区域的作用证明α-烯醇化酶也可能参与肝纤维化早期的炎性反应。然而随着疾病进展到不可逆的纤维化晚期，很多因素参与到发病机制里，肝硬化期细胞外基质比正常肝脏高6倍，因此推测α-烯醇化酶在肝纤维化早期作为一种促炎因子可起到重要作用，随着疾病发展，细胞外基质发挥主要作用，α-烯醇化酶的作用会逐渐减退，同时导致宿主对α-烯醇化酶的免疫应答减少。

肝纤维化的早发现、早治疗可在一定程度上阻止疾病的发展，因此诊断早期纤维化的血清标志物非常重要，本研究证实了α-烯醇化酶作为一种潜在的预测因子对肝纤维化的早期诊断价值，其对早期干预治疗、防止进展到肝硬化期、提高患者的生存率具有一定的应用价值。