肥胖中医体质与单核苷酸多态性的关系研究

郑 毅，赵友云△，汤 琪，黄 洁，谭 婕，李玉波

(1.湖北省中医院检验科，湖北武汉 430061；2.湖北省中医药大学教务处，湖北武汉 430065；3.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

肥胖已成为重要的社会和健康问题，它作为一种复杂的疾病，它由多种基因和环境因素共同影响，例如能量不均衡、生活方式、基因和家族史、药物、吸烟、年龄等。近年来，现代医学对肥胖的理论研究越来越热门，其中FTO基因是已经被广泛确认的肥胖相关基因之一。有研究表明，FTO基因上的SNP位点突变与肥胖的发生有密切关系[1-2]。另一方面，中医体质学认为体质与疾病具有相关性[2-4]，疾病的发生与预后的共同基础是患者的体质基础，体质决定了发病与否与发病的倾向性[5]。本研究，拟将现代西方医学认为的肥胖机理-基因突变与传统中医理论认为的中医体质结合起来，找出二者的关系。本研究的目的是找出中医体质分型的科学理论依据，探索中医体质类型与超重、肥胖的关系，从而为从中医调整体质的角度防控肥胖提供帮助。

1 资料与方法

1.1一般资料 一般资料选取2016年11月至2017年3月在湖北省中医院体检中心就诊的48例18岁以上的健康人群作为对照组，健康人群经测量身高、体质量，其身体质量指数(BMI)在18.50～24.99 kg/m2的正常范围内，并排除有心、脑、肝和造血系统等系统原发性疾病和糖尿病急性并发症的患者。对照组中，男26例，女22例，平均年龄43.45岁，平均身高1.73 m，平均体质量63.45 kg，平均BMI 21.20 kg/m2，平均全身脂肪含量(FM)14.03 kg，平均体脂百分比(PBF)22.12%。另选取2016年8月至2017年1月在湖北省中医院内科就诊的52例18岁以上的肥胖人群作为肥胖组，经测量身高、体质量，其BMI大于30.00。肥胖组中，男27例，女25例，平均年龄45.57岁，平均身高1.71 m，平均体质量93.10 kg，平均BMI 33.83 kg/m2，平均全身脂肪含量(FM)31.89 kg，平均体脂百分比(PBF)32.30%。两组别在年龄、性别、吸烟者构成比差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。分组原则是遵循世界卫生组织制定的基于BMI梯度划分的正常、超重和肥胖的范围。BMI值小于18.5 kg/m2的人群被认为体质量过轻；BMI大于25 kg/m2被认为超重；BMI大于30 kg/m2被认为肥胖。

1.2方法

1.2.1对照组与肥胖组基本资料的测量 48例对照组、52例肥胖组人群严格按照BMI和FM按照严格的人体测量标准进行测量，即身高体质量用标准身高体质量测量仪测量。脂肪含量由Hologic Delphi X射线吸收DXA扫描仪测量(Hologic Corporation,Waltham,MA,USA)。其中BMI的测量精密度变异系数为0.2%，FM的测量精密度变异系数为1.3%。

1.2.2DNA提取 完成上述测量之后，所有对照组、肥胖组标本均抽取3 mL外周静脉血。对临床样本取2 mL全血提取外周血单核细胞，DNA提取使用QIAamp DNA Blood Midi Kit，操作严格按照说明书进行。DNA提取后，使用紫外风光光度仪测量其OD260/280比值。上述DNA模板，使用无菌水重悬，并储存在-70 ℃[6-7]。

1.2.3肥胖组人群的中医分型 中医体质分型按照全国肥胖病研究学术会议制定的中医辨证分型标准[8]，按照“肝郁气滞型、脾虚湿阻型、胃热湿阻型、脾肾两虚型、阴虚内热型”进行分类判读，并计算频率。

1.2.4iMLDR引物设计 采用改良多重高温连接酶检测反应(iMLDR)技术，PCR扩增引物和连接引物均由上海生工技术有限公司合成，SNP位点检测由上海天昊生物科技有限公司合成。引物信息如下，见表1。

1.2.5PCR扩增、LDR连接反应 依据单重荧光定量PCR体系优化及扩增效率，反应体系为4 mM MgCl2，0.48 mM dNTP，0.5U Taq DNA聚合酶，0.29 μM上游引物，0.29 μM下游引物和5 μL DNA模板，加ddH2O至50 μL。反应条件为：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s， 65 ℃ 45 s， 72 ℃ 45 s， 10个循环； 94 ℃ 30 s， 65 ℃ 30 s， 72 ℃ 50 s 30个循环； 72 ℃ 5 min。扩增后的PCR产物经纯化进行iMLDR连接反应，总体系为20 μL：高温连接酶0.5 μL、5′连接引物混合液1 μL，3′连接引物混合液，纯化后的PCR产物5 μL，连接酶缓冲液2 μL，加ddH2O至20 μL[9-11]。

表1 iMLDR引物信息

1.2.6检测基因型 取1 μL连接产物与1 μL内标和9 μL甲酰胺混匀后，94 ℃变性3 min后，在ABI3500(美国ABI)上进行毛细管电泳测序。数据经GeneMapper 4.0软件处理，再上传至Genebank Blast比对，可直接判读其基因型[12]。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0软件进行统计学分析，数据以均数表示。将相关因素的统计内容作为变量，不同组之间的比较采用χ2进行单因素分析，对FTO基因的3个SNP位点rs9939609、rs1421085、rs8057044分别进行χ2检验验证是否符合Hardy-Weinberg平衡。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1肥胖组人群的中医体质分型 由一位副主任中医医师按照《中医辨证分型标准》对肥胖组人群进行体质分型结果如下。52例肥胖组人群中，按照中医体质分类人数由多到少依次为：肝郁气滞型、脾虚湿阻型、胃热湿阻型、脾肾两虚型、阴虚内热型。在年龄、性别、FM、PBF方面，5种中医症候之间差异无统计学意义(P>0.05)。其中在分型的过程中，还发现3种复合体质：肝郁气滞+胃热湿阻；脾虚湿阻+胃热湿阻；肝郁气滞+阴虚内热[13]。见表2。

2.2Hardy-Weinberg平衡的吻合度检验 如表3所示，rs9939609位点的等位基因及基因型分布在对照组(χ2=4.349，P=0.077)和肥胖组(χ2=3.121，P=0.140)符合哈迪温伯格平衡。rs1421085位点的等位基因及基因型分布在对照组(χ2=4.134，P=0.088)和肥胖组(χ2=2.619，P=0.120)符合哈迪温伯格平衡。rs8057044位点的等位基因及基因型分布在对照组(χ2=1.989，P=0.746)和肥胖组(χ2=0.186，P=0.671)符合哈迪温伯格平衡。选取的人群样本的基因型频率符合随机性原则，研究对象具有人群的代表性。

表2 肥胖人群中医体质分型结果

注：-表示无数据

表3 FTO基因3个SNP位点的Hardy-

续表3 FTO基因3个SNP位点的Hardy-

2.3对照组与肥胖组的等位基因频率比较 针对rs9939609(A/T)存在3种可能的基因型即：AA纯合子/AT杂合子/TT纯合子。48例对照组中，TT、AT、AA的表达频率分别为77.08%、20.83%、2.08%；A基因的频率为18.96%、T基因的频率为81.03%。52例肥胖组中，TT、AT、AA的表达频率分别为82.69%、9.61%、7.69%；A基因的频率为15.78%、T基因的频率为84.21%。基因型及等位基因的概率经χ2检验比较，差异无统计学意义(P=1.230、1.330)。

针对rs1421085(C/T)存在3种可能的基因型即：CC纯合子/CT杂合子/TT纯合子。48例对照组中，TT、CT、CC的表达频率分别为66.66%、27.08%、6.25%；C基因的频率为22.41%、T基因的频率为77.58%。52例肥胖组中，TT、AT、AA的表达频率分别为71.15%、19.23%、9.61%；A基因的频率为29.85%、T基因的频率为70.15%。经χ2检验分析，C基因及CC+CT基因型分布频率高于对照组，两组间差异有统计学意义(P=0.042、0.046)。

针对rs8057044(A/G)存在3种可能的基因型即：AA纯合子/AG杂合子/GG纯合子。48例对照组中，GG、AG、AA的表达频率分别为83.33%、8.33%、8.33%；A基因的频率为15.38%、G基因的频率为84.62%。52例肥胖组中，GG、AG、AA的表达频率分别为50.00%、36.53%、13.46%；A基因的频率为36.62%、G基因的频率为63.38%。经χ2检验分析，A基因及AA+AG基因型分布频率高于对照组，两组间差异有统计学意义(P=0.023、0.018)。见表4。

表4 基因型分布和等位基因频率比较[n(%)]

表5 SNP位点基因型在中医症候中的分布(n)

2.4中医肥胖症候与FTO基因SNP位点突变间的关系比较 统计在rs9939609、rs1421085、rs8057044基因在中医肥胖症候中的分布情况可以发现，rs9939609的A基因即突变基因在除脾肾两虚型中未分布外，在其他四型中均有分布，未见明显偏向性。rs1421085的C基因即突变基因从表5中可见，在脾虚湿阻型中大量分布，CT基因型占61.53%，CC基因型占23.08%，此外CC基因型在脾肾两虚型和阴虚内热型中未见分布。rs8057044的A基因即突变基因在脾肾两虚型大量分布。AG基因型占50%，AA基因型占50%；A基因同样在阴虚内热型中大量分布，AG基因型占75%，AA基因型占25%，此外GG基因型在这2种症候中未见分布。见表5。

3 讨 论

肥胖是一种典型的复杂疾病，它会引起很多健康问题，如冠心病、2型糖尿病、高血压、胆结石等等。但如何判断一个人是否肥胖的标准，有很多的方法。目前，现代医学公认的方法是测量BMI。症候是中医理论的核心内容，也是众多中医现代化研究的关键问题之一。因此，尽快为中医体质分型寻找理论依据显得尤为关键[14]。中医系统内部的症候辨证方法不一，证型繁多。现代中医学承认的大致有数十种之多，除本文提到的5种外，还有胃肠实热、气血瘀滞、寒湿凝滞、阴虚血燥等，其中不少证型是名异而实同[15-16]。中医药在改善肥胖病症状和改善患者生活质量方面具有巨大潜力，但现代西方医学认为中医症候分型缺乏说服力。本研究证明了肝郁气滞型、脾虚湿阻型、胃热湿阻型在肥胖人群中较多分布，但5种体质在肥胖程度上未见明显差异。

本研究所选取的3个FTO基因的SNP位点rs9939609、rs1421085、rs8057044是目前公认的与肥胖高度相关SNP位点，国内也有不少学者针对上述位点做了研究[17]。rs9939609位点中的基因型分布在对照组和肥胖组中差异无统计学意义(P>0.05)，rs1421085、rs8057044的突变基因的频率在肥胖组中明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。故本文认为rs9939609不适合作为本地区人群的肥胖突变位点。且rs9939609与5种中医体质分布无明显关系，结果还表明rs1421085与脾虚湿阻型、rs8057044与脾肾两虚型和阴虚内热型高度相关。

4 结 论

本文采用现代分子生物学方法iMLDR探索了5种中医体质与肥胖基因SNP位点间的关系，结果表明：FTO基因的rs9939609的A基因在肥胖组和对照组中差异无统计学意义，可加大样本量研究此位点是否适用于黄种人肥胖基因分型，且不推荐作为中医体质分型的指标；rs1421085与脾虚湿阻型高度相关，rs8057044与脾肾两虚型和阴虚内热型高度相关。