绿升麻中黄酮类成分的纯化与含量测定研究

孙伟健，于 野

(长春东方职业学院，吉林 长春 130000)

绿升麻，为毛茛科植物类叶升麻的根茎。具有散风热，祛风湿等功效[1]。研究表明黄酮类物质具有较强的生理活性，且无毒无害，具有抗癌、抗肿瘤、抗炎镇痛等作用[2]。据文献报道，绿升麻属植物植株各部分均含有黄酮类化合物，并为本属植物最主要的化学成分[3]。采用超声波法提取绿升麻中的黄酮，因为索氏提取植物的有效成分，操作简便快捷、提取率高、速度快、提取物的结构未被破坏、效果好[4]。大孔吸附树脂吸附分离技术是采用大孔树脂从中药中选择性吸附目标成分、分离其它成分的一种绿色与节能技术，具有选择性好、吸附容量大、再生处理方便、操作简单等优点[5-6]。本实验选用AB-8型大孔吸附树脂对提取物进行了纯化。

1 仪器与材料

SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化学仪器厂)；Agilent-1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；FA2004电子天平(上海恒平科学仪器有限公司)；有机溶剂为国药集团上海试剂厂产品，其它试剂为分析纯。

芦丁、槲皮素、芹菜素标准品(中国食品药品检定研究院)。

2 提取与分离

称取90 g绿升麻粉末，甲醇浸泡24 h，温度40℃，索氏提取4 h，将提取液合并，冷却，蒸馏，得浸膏3.4838 g。浸膏甲醇溶解，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到4种萃取物。

采用湿法装柱，乙醇为洗脱剂。加入1 g浸膏的醇溶液，用30%、40%、45%、70%乙醇梯度洗脱，得粉末状样品0.0988 g。

取芦丁，槲皮素，芹菜素标准品，精密称定10 mg，置于10 mL容量瓶中，加入少量甲醇，得对照品溶液。精密称取干燥的样品粉末10 mg，三份，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀得待测溶液。

色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm ID，5 μm)及保护(12.5 mm×4.6 mm ID，5 μm)流动相为色谱级乙腈和0.4%的磷酸水溶液，比例为13:87；流速1 mL/min；检测波长327 nm；柱温25℃；进样量10 μL。根据色谱条件绘制谱图。结果见图1～3。

分别取配制好的对照品溶液0.5、0.75、1.0、1.25、1.5mL，分别置于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，制成系列混合对照品溶液。以浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，求出线性回归方程，绘制标准曲线。

精密量取芦丁，槲皮素，芹菜素样品适量。置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，浓度分别为1.0、0.5、0.5 mg/mL，取0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL于10 mL容量瓶中定容，按上述色谱条件测定峰面积，根据标准曲线计算黄酮的含量。

3 结果与讨论

3.1 最佳的纯化洗脱条件

研究发现，乙酸乙酯层黄酮的含量最高，三倍量体积的萃取效果最好。使用AB-8型大孔吸附树脂纯化，用不同浓度的乙醇洗脱黄酮后，70%的乙醇洗脱的黄酮最多。

夫妻俩当然也有不同的地方，张允和是“诗化的人”，富于传统文化韵味，周有光则是“科学的人”，条理明晰，滔滔善辩。性格不同，并不相互抵触，而是相互补充，以音乐为例，他跟着她去听昆曲，她则跟着她一起听西洋音乐。

3.2 高效液相色谱法含量测定的结果

3.2.1 标准品测定图谱

图1 氯仿层中黄酮含量的高效液相色谱图

图2 乙酸乙酯层中黄酮含量的高效液相色谱图

图3 正丁醇中黄酮含量的高效液相色谱图

3.2.2 标准曲线制备的结果

表1 绿升麻中的黄酮成分线性回归方程

用HPLC法在波长320 nm处测定，进行一元线性回归，得回归方程见表1。

芦丁在62.5～1000 g·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系，芹菜素在31.25～0.5 g·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系，槲皮素在31.25～0.5 g·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系，工作曲线结果见表2。

表2 芦丁、槲皮素、芹菜素工作曲线测定结果

3.2.3 精密度试验的结果

准确量取同一质量浓度的供试液连续测定5次，测定峰面积，结果：芦丁RSD=0.16 %，槲皮素RSD=0.12%，芹菜素RSD=0.39%(n=5)，表明精密度良好。详细结果见表3。

表3 芹菜素、芦丁、槲皮素精密度试验结果

3.2.4 重现性试验的结果

取供试品溶液中的样品5份，按照上述色谱条件操作，含量测定结果见表4。

表4 芦丁、槲皮素、芹菜素重复性试验结果 (n=5)

计算得RSD为0.06%(n=5)。测定结果显示，本试验测定方法的槲皮素含量重复性良好。

计算RSD为0.06%(n=5)。测定结果显示,本试验测定方法的芹菜素含量重复性良好。

3.2.5 稳定度试验的结果

取同一供试液，在相同的色谱条件下分别在0,1,2,3,4,5 h按上述色谱条件测定峰面积(见表5)，芦丁RSD值为0.16%，槲皮素RSD值为0.15%，芹菜素RSD值为0.36%，符合有关规定。

表5 芦丁、槲皮素、芹菜素稳定度试验结果表

3.2.6 样品含量测定的结果

由标准曲线计算含量。纯化前绿升麻中芦丁含量为1.5%，槲皮素含量为1.3%，芹菜素的含量为1.0%。纯化后样品中氯仿层中的黄酮类成分含量在81.7%，乙酸乙酯层中的黄酮类成分含量在97%，正丁醇中黄酮类成分的含量在84.6%。