响应面法优化金针菇麦角硫因的提取工艺

胡晶晶,张怡馨,王 艳,莫宇丽,王 杰

(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

随着人们健康意识的增强,以天然抗氧化剂取代合成抗氧化剂是食品与添加剂行业的发展趋势。作为一种新型的天然强抗氧化剂,麦角硫因不仅能抑制和清除由氧化反应引起的食品变味、变色与酸败,而且对人体能起到抗衰老、提高免疫力、减少某些疾病发生率的作用,在食品添加剂、保健品、化妆品等领域具有巨大的应用潜力[1-4]。金针菇等食用菌中麦角硫因的含量远高于其它的麦角硫因合成生物,而食用菌又具备人们所需的天然安全性,又有易培养、周期短等优势,成为获取麦角硫因的最佳来源[5-7]。

原材料的预处理方式通过影响活性成分的活性进而影响其提取量。所选溶剂会直接影响有效成分从植物组织中溶解出来的效率[8-9]。Bao等[10]以70%的丙酮作为提取溶剂提取金针菇中的麦角硫因,得到金针菇子实体中麦角硫因含量为(3.03±0.07) mg/g干重;张翠等[11]以去离子水作为提取溶剂,100 ℃加热回流来提取多种食用菌中的麦角硫因,测得金针菇中麦角硫因的含量为0.186%。除此之外,提取方法对提取量也有很大的影响,不同的提取方法都有其优劣势。传统的提取方法操作简单,仪器辅助提取效率高。目前,国内外对麦角硫因的研究多集中于功能特性,关于其提取纯化方面的研究较少[12-16],采用响应面对提取方法进行工艺优化鲜有报道[17],而市场对麦角硫因存在着巨大需求。响应面法是一种有效的统计方法,通过分析实验数据,建立数学模型,从而解决受多因素影响的最优组合问题[18]。为此,本论文以金针菇为对象,选择提取溶剂与提取方法,利用响应面法优化金针菇中麦角硫因的提取工艺,为金针菇中麦角硫因的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金针菇 广东蓝田农业有限公司;麦角硫因标准品 美国Sigma公司;磷酸二氢钾、磷酸、盐酸、乙醇、甲醇、丙酮等 均为国产分析纯,广州成硕试剂公司;甲醇、乙腈 色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司。

LC2130高效液相色谱仪 上海天美科学仪器有限公司;FD-1-50真空冷冻干燥机 天津比朗实验仪器制造有限公司;MAS-Ⅱ常压微波萃取仪 上海新仪微波化学科技有限公司;JY92-2D超声细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司;DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱 上海紫裕生物科技有限公司;HH-1数显恒温水浴锅 荣华仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 金针菇粉的制备 取一定量新鲜金针菇,洗净后分装于自封袋中并置于-70 ℃冰箱12 h。真空冻干机冷阱温度-50 ℃以下,真空度20 Pa以下干燥直至恒重。将干燥后的金针菇取出,置于高速粉碎机中充分粉碎,过70目不锈钢网筛,置于-20 ℃冰箱中密封保存备用。

1.2.2 溶剂提取法 将冷冻干燥处理所得的金针菇粉与54%乙醇以液料比48∶1 (g/mL)混合,即准确称量0.5 g金针菇粉,将24 mL的54%乙醇缓慢加入,边加边搅拌,将结块的菇粉尽量搅拌开,使菇粉与提取剂最大面积接触,即得到固液混合物;将固液混合物于70 ℃恒温水浴提取30 min,混合物常温下8000 r/min离心10 min后收集上清液,用54%乙醇定容上清液至50 mL,检测麦角硫因提取量。在前期预实验的基础上确定实验最佳参数。

1.2.3 超声辅助溶剂提取法 使用超声细胞粉碎仪将固液混合物于超声功率440 W、超声时间5 min条件下提取。将提取液离心后收集上清液,用54%乙醇定容至50 mL,检测麦角硫因提取量。

1.2.4 微波超声联合提取法 使用微波萃取仪将固液混合物于微波功率400 W、微波温度70 ℃下处理5 min,再使用超声细胞粉碎仪于超声功率440 W、超声时间5 min条件下提取;将提取液离心后收集上清液,用54%乙醇定容至50 mL,检测麦角硫因提取量。

1.2.5 二次提取法 二次提取法即为在溶剂提取法的基础上,向离心取出上清液后的残渣再次加入提取溶剂54%乙醇,并振荡使残渣与提取溶剂充分接触后,再次以溶剂提取法的条件进行二次提取,同样离心后收集上清液;合并两次收集的上清液,用54%乙醇定容至50 mL,检测麦角硫因提取量。

1.2.6 溶剂提取法提取金针菇中麦角硫因的单因素实验

1.2.6.1 液料比对麦角硫因提取量的影响 用80%乙醇分别以不同液料比(mL/g)20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1与金针菇粉充分混合,在70 ℃下水浴浸提30 min,取出后于10000r/min离心10 min后收集上清液,80%乙醇定容至50 mL,并测定麦角硫因提取量。

1.2.6.2 乙醇浓度对麦角硫因提取量的影响 分别用去离子水、20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇作为提取溶剂,以液料比50∶1 (mL/g)与金针菇粉充分混合,在70 ℃下水浴浸提30 min,取出后于10000 r/min离心10 min后收集上清液,用相应的提取溶剂定容至50 mL,并测定麦角硫因提取量。

1.2.6.3 提取温度对麦角硫因提取量的影响 用60%乙醇以液料比50∶1 (mL/g)与金针菇粉充分混合,分别在40、50、60、70、80、90和100 ℃下水浴浸提30 min,取出后于10000 r/min离心10 min后收集上清液,60%乙醇定容至50 mL,并测定麦角硫因提取量。

1.2.6.4 提取时间对麦角硫因提取量的影响 用60%乙醇以液料比50∶1 (mL/g)与金针菇粉充分混合,在50 ℃条件下分别水浴浸提2、5、15、30、45、65、85、105和120 min,取出后于10000 r/min离心10 min后收集上清液,60%乙醇定容至50 mL,并测定麦角硫因提取量。

1.2.6.5 响应面法优化金针菇中麦角硫因的提取工艺 根据前期各个单因素实验分析的结果,选取单因素实验中对提取量影响较大的三种因素:乙醇浓度、提取温度、液料比,采用 Design Expert 8.0.6 软件中的Box-benhnken实验设计原理进行优化设计[19],响应面实验设计因素水平表见表 1。

表1 响应面实验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.7 提取液中麦角硫因浓度的检测方法 采用高效液相色谱法(HPLC)检测提取液中麦角硫因的浓度[20]。检测条件:色谱柱为5 μm C18色谱柱,柱温30 ℃;流动相为水∶甲醇=98∶2,流速为1 mL/min,检测波长为254 nm,进样量为20 μL。

标准曲线的制作:将1 mg麦角硫因标准品用10 mL提取溶剂溶解,制成浓度为0.1 mg/mL(100 μg/mL)的标准品原液,再将原液分别稀释成75、50、25和5 μg/mL的麦角硫因标准品溶液,标准品和提取液均进HPLC,使用以上检测条件检测;以麦角硫因浓度(mg/mL)为纵坐标,以峰面积(μAU·s)为横坐标,绘制麦角硫因标准曲线,得出曲线回归方程:y=1.41117×10-8x+8.14078×10-5,R2=0.99994,其中y为麦角硫因浓度,x为峰面积。

1.2.8 麦角硫因提取量的计算 计算公式为:

式中,Y为麦角硫因的提取量(mg/g),y为按照标准曲线计算得出的麦角硫因浓度(mg/mL),V为进液相前溶液定容的体积(mL),m为称取金针菇粉的质量(g)。

1.3 数据处理

试验重复3次,采用 Design Expert 8.0.6 软件进行响应面分析,利用SPSS 统计软件进行数据分析,Origin 8.6进行绘图。

2 结果与分析

2.1 提取方法对金针菇中麦角硫因提取量的影响

由图1,比较不同提取方法所得麦角硫因的提取量,4种提取方法中麦角硫因得率大小顺序为:二次提取法>溶剂提取法>微波-超声联合提取>超声提取。其中,溶剂二次提取法显著(p<0.05)高于其他提取方法。在大量使用超声波辅助萃取、微波-超声辅助萃取技术的研究中,均提出这些方法相较于常规的溶剂提取法具有快捷省时、能耗少、有效成分得率高等优势[21-22]。而本实验中,使用超声提取和微波-超声联合提取金针菇粉中的麦角硫因,其提取量却低于溶剂提取法的提取量,与其他活性物质提取研究中的结果大相径庭。推测可能跟金针菇特殊的细胞结构特征有关,导致发挥不了超声对提取过程的强化作用,甚至可能超声或微波导致了提取物的结构与性质发生改变,使提取率降低[23]。二次提取法是在溶剂提取法的基础上进行第二次提取,但其麦角硫因的提取量仅比溶剂提取法高12%左右,因而从节省试剂和时间的角度出发,之后的提取过程均采取一次提取,即溶剂提取法。

图1 提取方法对金针菇中麦角硫因提取量的影响Fig.1 Effect of extraction method on extraction yield of Flammulina velutipes ergothioneine注:不同小写字母表示每种方法之间的差异显著(p<0.05)。

2.2 溶剂提取法提取金针菇中麦角硫因的单因素实验

2.2.1 液料比对金针菇中麦角硫因提取量的影响 由图2所示,用80%乙醇做提取剂,检测不同液料比对金针菇中麦角硫因提取量的影响。液料比不同对麦角硫因的提取率有一定的影响,这与薛天凯等[24]的研究报道变化趋势一致;在液料比20∶1～50∶1的范围内随着乙醇溶液用量的增加,麦角硫因提取量逐渐升高,可能的原因是当乙醇溶液用量少时,乙醇溶液黏度较高,分子扩散慢,体系分散不均匀[25];在液料比50∶1提取量最高。随着溶剂用量的增大,会增大工艺成本,增加能耗和后续操作的时间,故为节约资源实验,提高效率,适宜的液料比为50∶1。

图2 液料比对金针菇中麦角硫因提取量的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of Flammulina velutipes ergothioneine注:不同小写字母表示差异显著(p<0.05);图3～图5同。

2.2.2 乙醇浓度对金针菇中麦角硫因提取量的影响 结果如图3所示,金针菇中麦角硫因的提取量随着提取溶剂中乙醇浓度的升高先升高后下降,并且以60%乙醇为提取溶剂时的提取量显著(p<0.05)高于其他乙醇浓度的提取溶剂,平均为2.237 mg/g(干重)。这与其他活性物质的研究报道变化趋势一致[26]。可能的原因是随着乙醇浓度的上升,增加了乙醇与麦角硫因的接触机会,导致麦角硫因较多地溶解在乙醇中。但当溶液中乙醇浓度达到一定范围时,提取量反而下降,可能的原因是乙醇浓度增大使得一些醇溶性杂质溶出量增加，从而与麦角硫因竞争,导致提取量下降[27]。从节约资源与成本的因素考虑,乙醇浓度60%为宜。

图3 乙醇浓度对金针菇中麦角硫因提取量的影响Fig.3 Effect of ethanol ratio on extraction yield of Flammulina velutipes ergothioneine

2.2.3 提取温度对金针菇中麦角硫因提取量的影响 结果如图4所示,麦角硫因的提取量在提取温度40～100 ℃的范围内先升后降,于50 ℃达到最高值平均2.56 mg/g(干重),并且显著(p<0.05)高于其他提取温度下的提取量。这与刘杨等[28]考察提取温度对活性物质多酚提取率的影响的研究结果一致。可能的原因是温度越高,分子运动加快,提取剂与菇粉分子间碰撞越激烈,且温度升高能够降低提取溶剂的黏度,促进溶剂介质的传递,增加麦角硫因在乙醇中的溶解度。温度高于50 ℃后麦角硫因提取量呈下降趋势,可能的原因有:一是高温下麦角硫因不稳定;二是高温提取激活了细胞的某种保护机制,消耗了细胞内的麦角硫因;三是虽然温度升高使胞内物质溶出度增高,但不仅是麦角硫因,蛋白、多糖等大分子和其他杂质在提取液中的浓度也随之提高,从而与麦角硫因形成竞争,故而使提取量下降。因此适宜的提取温度为50 ℃。

图4 提取温度对金针菇中麦角硫因提取量的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield of Flammulina velutipes ergothioneine

2.2.4 提取时间对金针菇中麦角硫因提取量的影响 结果如图5所示,在2～15 min之间,提取量有缓慢上升的趋势,但差异并不显著,这是因为开始时麦角硫因没有完全溶解,随着时间增加,水溶性麦角硫因不断溶出。提取时间为15 min时提取量最大,平均值2.87 mg/g(干重),最高值可达3.11 mg/g(干重),从节约时间和提取率的角度出发,提取时间控制在15 min较好。

图5 提取时间对金针菇中麦角硫因提取量的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of Flammulina velutipes ergothioneine

2.3 响应面法优化金针菇中麦角硫因的提取工艺

2.3.1 响应面试验设计方案及结果 综合单因素实验结果,固定提取时间15 min,选取乙醇浓度(X1)、温度(X2)、液料比(X3)3个因素,在单因素实验基础上，采用三因素三水平利用Design Expert 8.0.6 软件中的Box-benhnken实验设计原理进行响应面设计,根据试验设计确定的试验方案对麦角硫因提取进行优化,试验方案及结果见表2。所获得麦角硫因的提取量优化拟合方程为:

表2 麦角硫因提取的响应面试验方案与结果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

表3 二次回归模型的方差分析结果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.3.3 交互作用分析 为了进一步研究相关变量之间的作用以及确定最优点,通过 Design Expert 软件绘制响应面曲线图来进行可视化分析,图6～图11分别显示3组以麦角硫因提取量为响应值的趋势图,反映了两被测变量间交互作用显著与否,椭圆表示的是两因素交互作用显著,圆形则表示不显著[29]。

图6、图7分别为乙醇浓度和温度对麦角硫因提取量的响应面图、等高线图。固定液料比为50∶1,随着温度和乙醇浓度的增加,麦角硫因的提取量呈现先升高后下降的趋势。乙醇浓度轴向等高线更为密集,乙醇浓度对提取量的影响极明显,温度轴向等高线相对稀疏,表明其对提取量的影响相对乙醇浓度较小(图7)。结合表3,得出结论:麦角硫因提取量对乙醇浓度的变化比温度的变化敏感,两因素具有一定的交互作用,但交互作用不显著(p>0.05)。响应曲面图开口向下,表明在实验所选范围内存在极大值,在乙醇浓度60%～70%、温度45～55 ℃内为最佳水平范围。

图6 乙醇浓度和温度对麦角硫因提取量的响应面图Fig.6 Response surface showing the effect of ethanol ratio and temperature on the yield of ergothioneine

图7 乙醇浓度和温度对麦角硫因提取量的等高线Fig.7 Corresponding contour plots showing the effect of ethanol ratio and temperature on the yield of ergothioneine

图8、图9分别为乙醇浓度和液料比对麦角硫因提取量的响应面图、等高线图。等高线近似成圆形。固定温度为50 ℃,随着液料比和乙醇浓度的增加,麦角硫因的提取量呈现先增大后下降的趋势。乙醇浓度轴向等高线更为密集,乙醇浓度对提取量的影响极显著(图8),液料比轴向等高线相对稀疏,表明其对提取量的影响相对较小(图9)。结合表3,得出结论:麦角硫因提取量对乙醇浓度的变化比液料比的变化敏感,两因素具有一定的交互作用,但不显著(p>0.05)。此外,响应曲面图开口向下,表明在实验所选范围内存在极大值,在乙醇浓度60%～70%、液料比45∶1～55∶1内为最佳水平范围。

图8 乙醇浓度和液料比对麦角硫因提取量的响应面图Fig.8 Response surface showing the effect of liquid-solid ratio and ethanol ratio on the yield of ergothioneine

图9 乙醇浓度和液料比对麦角硫因提取量的等高线Fig.9 Corresponding contour plots showing the effect of liquid-solid ratio and ethanol ratio on the yield of ergothioneine

图10、图11分别为液料比和温度对麦角硫因提取量的响应面图、等高线图。如图所示,温度的坡面较液料比的陡,等高线为圆形。固定乙醇浓度为60%,随着温度和液料比的增加,麦角硫因的提取量呈现先增大后下降的趋势。沿温度轴向等高线密集,而液料比轴向等高线相对稀疏,结合表3,说明麦角硫因提取量对温度的变化比对液料比的变化更为敏感,但两因素的交互作用不显著(p>0.05)。响应曲面图开口向下,表明在实验所选范围内存在极大值,在液料比45∶1～55∶1、温度50～55 ℃内为最佳水平范围。

图10 液料比和温度对麦角硫因提取量的响应面图Fig.10 Response surface showing the effect of liquid-solid ratio and temperature on the yield of ergothioneine

图11 液料比和温度对麦角硫因提取量的等高线Fig.11 Corresponding contour plots showing the effect of liquid-solid ratio and temperature on the yield of ergothioneine

2.3.4 最佳工艺确定与验证 经过模型预测得到最佳工艺条件为:乙醇浓度62.21%,液料比57.54∶1,温度52.34 ℃。为方便操作将麦角硫因的提取最佳工艺条件改为乙醇浓度62%,液料比58∶1,温度53 ℃,代入拟合方程得到的提取量为3.48(mg/g干重),此条件下进行3 个平行试验验证,麦角硫因的提取量为(3.53±0.09) mg/g干重。实测值与预测值相近,证明用响应面法优化麦角硫因提取的工艺是可行的。

3 结论

不同提取方法对金针菇麦角硫因提取量影响的研究结果表明:不同的提取方法可显著(p<0.05)影响金针菇麦角硫因的提取量,其中,溶剂二次提取法>溶剂提取法>微波超声联合提取法>超声提取法。通过单因素实验和响应面法优化溶剂提取法提取麦角硫因的条件，结果表明:在所选取的单因素中,对提取量影响较大的三个因素分别为提取温度、液料比和乙醇浓度;单因素和响应面法得到的最优提取条件为:提取时间15 min,乙醇浓度62%,液料比58∶1,温度53 ℃,此条件下麦角硫因的提取量为(3.53±0.09) mg/g干重。优化模型能较好地预测溶剂提取麦角硫因提取量。