PI3K/Akt通路在缺氧活化钙敏感受体介导的A549细胞转移中的作用

2019-06-24李光伟张宁宁

中国药理学通报 2019年6期

李光伟，王珺，肖薇，金莉，李波，赵宇，张宁宁，汪娜

(齐齐哈尔医学院病理生理学教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006)

肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。钙离子与钙信号转导在肺癌发生中起重要作用，但其具体机制尚未阐明。钙敏感受体(calcium-sensing receptor，CaSR)是细胞膜上的一种G蛋白偶联受体[2]，其在肿瘤的发生中发挥着重要作用，但CaSR在肺癌转移中的作用鲜有报道。我们前期研究发现，CaSR蛋白在人非小细胞肺癌组织中表达增强，其表达强度与肿瘤大小、肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移情况有关，提示在非小细胞肺癌中，CaSR的表达可能与肿瘤细胞的增殖及侵袭、转移密切相关[3]。为探究CaSR在肺癌转移中的具体机制，本实验以A549及A549/DDP细胞为研究对象进行研究，以期为肺癌的防治提供新的药物作用靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞人肺腺癌细胞A549、耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP，购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 试剂与仪器基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)ELISA试剂盒，购于美国R&D公司；Transwell小室，购于Corning公司；CaSR、MMP-2、Akt、p-Akt、GAPDH的一抗及二抗，均购于Santa Cruz公司；LY294002(PI3K/Akt通路抑制剂)、NPS2143(CaSR抑制剂)、GdCl3(CaSR激动剂)，购于Sigma公司。缺氧培养箱及酶标仪(Thermo)；倒置显微镜(Olympus)；DF-D型恒压恒流电泳仪(北京六一厂)；高速离心机(美国Sigma公司)；化学发光成像系统(上海天能科技有限公司)。

1.3 实验分组及缺氧模型的复制A549及A549/DDP细胞在37 ℃、5% CO2条件下，含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI 1640培养基中培养，顺铂维持浓度为2 mg·L-1。将处于对数生长期的细胞随机进行分组。对照组(control)：细胞无血清培养24 h后，正常培养箱无血清培养24 h；缺氧组(H)：细胞无血清培养24 h后，缺氧箱内无血清培养24 h(93% N2、2% O2、5% CO2)；GdCl3干预组(H+Gd)：细胞无血清培养24 h，加入GdCl3(300 μmol·L-1)后，缺氧箱内无血清培养24 h；NPS2143干预组(H+NPS)：细胞无血清培养24 h，加入NPS2143(10 μmol·L-1)后，缺氧箱内无血清培养24 h；LY294002干预组(H+LY+Gd)：细胞无血清培养24 h，加入LY294002(10 μmol·L-1)孵育30 min后，加入GdCl3(300 μmol·L-1)，缺氧箱内无血清培养24 h[4]。

1.4 Western blot检测CaSR、MMP-2、Akt、p-Akt的蛋白水平各细胞组达到实验终点后，细胞刮下后，加入蛋白裂解液及PMSF，冰上孵育40 min，4 ℃、12 000 r·min-1离心20 min，上清进行蛋白定量。取20 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳，300 mA转移2 h至硝酸纤维素薄膜，封闭1 h；分别加入一抗MMP-2、Akt、p-Akt、GAPDH(1 ∶500)4 ℃过夜。洗膜，二抗(1 ∶1 000)孵育1 h，显色发光，吸光度扫描，半定量分析显影条带[5-7]。

1.5 ELISA法检测MMP-2含量收集各组细胞上清液，1 500 r·min-1离心10 min，取上清液1 mL待测。实验步骤按ELISA试剂盒说明书进行。所有标本均进行3个复孔检测，并为同批测定，均值为终质量浓度。分别以标准物的质量浓度及450 nm波长的吸光度(A)值为横纵坐标，在半对数坐标纸上绘出标准曲线。在坐标曲线上通过样品A值，查出相应的样品质量浓度(μg·L-1)[8]。

1.6 Transwell小室检测细胞侵袭情况按照基质胶 ∶DMEM=1 ∶29比例稀释后，向上室铺基质胶。细胞分组同“1.3”，各组细胞分别离心后用无血清培养基重悬，调整细胞悬液浓度1.0×109·L-1种于上室，下室加入含有10% FBS的完全培养基600 μL，按照分组情况，分别于上室内加药后置于常氧及缺氧箱内培养24 h；将上室取出，用棉签擦去上室内未迁移的细胞，PBS冲洗2次；甲醇固定上室细胞20 min；PBS冲洗2次，适当风干后，0.5%结晶紫染色20 min，PBS冲洗2次，风干。倒置显微镜高倍镜下任意选取5个不相同的视野，拍照并计数细胞[9]。

1.7 划痕实验检测细胞迁移情况细胞分组同“1.3”。取2块6孔板，用marker笔分别在每块板背面划横线，每隔0.5～1 cm划一道，横穿过孔，每孔至少穿过5条线。每孔加入约5×105个细胞，以过夜能铺满为标准，细胞贴壁后去血清24 h。次日用200 μL的枪头比着直尺，垂至于背后的横线划痕。PBS冲洗3次，去除划下的细胞，按分组情况分别处理及加药，其中一块板置于正常培养箱内，另一块板置于缺氧箱内，分别培养24 h。取样，拍照[10]。分别测量0 h和24 h的划痕宽度，迁移距离=0 h的划痕宽度-24 h的划痕宽度。

2 结果

2.1 不同处理因素对CaSR表达的影响如Fig 1所示，与对照组比较，H组CaSR表达增加(P<0.05)；与H组比较，GdCl3能增加CaSR表达(P<0.05)，CaSR抑制剂NPS2143的作用相反，A549/DDP细胞CaSR蛋白表达结果与A549细胞一致。

Fig 1 The protein expression of CaSR determined by Western blot in different groups of A549 and A549/DDP

H: hypoxia, NPS: NPS2143.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group.

2.2 不同处理因素对细胞MMP-2蛋白表达的影响如Fig 2所示，与对照组比较，H组MMP-2蛋白表达增加(P<0.05)；与H组比较，缺氧基础上GdCl3和NPS2143分别能上调和下调这种作用(P<0.05)；与H+GdCl3组比较，LY294002能够抑制MMP-2蛋白的表达上调(P<0.05)，A549/DDP细胞MMP-2的变化趋势与A549细胞一致。

2.3 不同处理因素对p-Akt蛋白水平的影响2种细胞Western blot检测结果显示(Fig 3)，与对照组比较，缺氧能够上调Akt蛋白磷酸化水平(P<0.05)；与H组比较，缺氧基础上GdCl3能够进一步增加其磷酸化的水平(P<0.05)；与H+GdCl3比较，这种促进效应可以被PI3K通路阻断剂LY294002抑制(P<0.05)；NPS2143则与GdCl3作用相反。

Fig 2 The protein levels of MMP-2 in A549 and A549/DDP cells determined by Western

H: hypoxia; NPS:NPS2143; LY: LY294002.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group;△P<0.05vsH+GdCl3group.

Fig 3 The protein levels of p-Akt in A549 and A549/DDP cells

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group;△P<0.05vsH+GdCl3group

2.4 不同处理因素对细胞分泌MMP-2的影响如Fig 4所示，H组A549及A549/DDP细胞上清液中的MMP-2蛋白浓度高于对照组(P<0.05)，但却明显低于H+GdCl3组(P<0.05)，而缺氧和GdCl3的作用可被PI3K抑制剂LY294002所抑制(P<0.05)，NPS2143则与GdCl3作用相反。

Fig 4 Level of MMP-2 in A549 and A549/DDP cell cultured

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group;△P<0.05vsH+GdCl3group

2.5 不同处理因素对细胞侵袭的影响Transwell结果显示(Fig 5)，在A549及A549/DDP细胞，与对照组比较，H组平均每个高倍(400倍)视野穿过滤膜的细胞数明显增加(P<0.05)，提示缺氧可明显增加A549细胞的运动侵袭能力。缺氧基础上NPS2143能抑制A549细胞侵袭，GdCl3能促进其侵袭(P<0.05)，但这种促进作用可被LY294002阻断(P<0.05)。

2.6 不同处理因素对细胞迁移能力的影响如Fig 6所示，在A549细胞H组较对照组迁移距离增加(P<0.05)；与H组比较，NPS2143抑制细胞迁移(P<0.05)，GdCl3能促进A549细胞的迁移(P<0.05)，而PI3K抑制剂LY294002则可抑制GdCl3的作用(P<0.05)，A549/DDP细胞迁移的变化趋势与A549细胞一致。

3 讨论

侵袭和转移是临床上恶性肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因，因此，揭示恶性肿瘤转移的机制，将有助于判断患者预后和选择合理、有效的治疗方案, 延长患者的生存期限及提高生活质量。目前，我国已为世界第一肺癌大国，因此肺癌的诊疗已成为我国临床工作者面临的严峻挑战。钙离子作为细胞内重要的信息分子，可以激活不同的信号通路，参

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group;△P<0.05vsH+GdCl3group

与许多重要生命活动的调节。恶性肿瘤发生、发展过程常伴随钙离子信号的异常，但其发生机制不甚清楚。因此，认识钙信号在肺癌发生、发展中的作用，对于进一步揭示肺癌发生的分子机制，改善患者预后，提高其生存质量有重要意义。

CaSR是G蛋白偶联受体C家族成员之一。Brown等[2]于1993年首先从牛的甲状旁腺中克隆出CaSR。CaSR在维持全身钙的平衡系统中具有重要作用，此外，还可参与细胞增殖、分化、分泌、趋化、凋亡、基因表达、离子通道开关、维持膜电位、衰老等过程。大量研究表明，CaSR在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。CaSR是影响乳腺癌预后的独立风险因子[11-12]。本课题组前期研究发现，CaSR蛋白在非小细胞肺癌组织中表达增强，其表达强度与肿瘤大小、肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移情况密切相关，提示在非小细胞肺癌中CaSR的表达或活化可能与肿瘤细胞的增殖及侵袭、转移相关[3]。但其具体发生机制如何，目前尚无相关报道。

众所周知，实质性肿瘤细胞物理微环境的基本特征之一是缺氧，缺氧可活化多种细胞膜上的CaSR[13]。研究中，我们观察到缺氧能够上调A549及A549/DDP细胞CaSR蛋白的表达，在此基础上，GdCl3能够进一步加强CaSR的表达，而CaSR抑制剂NPS2143能减弱CaSR的表达，说明缺氧能够活化A549及A549/DDP细胞的CaSR。

Brennan等[14]研究表明，激活的CaSR能够促进乳腺癌及前列腺癌骨转移的发生。新近研究揭示，CaSR在体内和体外促进肾细胞癌的骨转移进程[15]。本研究结果显示，缺氧促进A549及A549/DDP细胞迁移距离，增加穿过滤膜细胞数量和侵袭能力。上述这些作用能够被CaSR激动剂GdCl3所增强，被CaSR激动剂NPS2143所抑制，提示缺氧活化的CaSR可能参与了A549及A549/DDP细胞的迁移和侵袭过程。

基底膜或细胞外基质的降解是肿瘤浸润转移的重要环节，MMP-2和MMP-9能有效降解基底膜或细胞外基质，在肿瘤的浸润和转移灶的形成过程中起重要作用。本研究显示，缺氧组A549及A549/DDP细胞MMP-2蛋白表达增多，同时分泌到培养液中的MMP-2蛋白浓度增加，GdCl3能上调缺氧的这种效应，NPS2143作用相反。说明缺氧活化的CaSR可能通过促进A549及A549/DDP细胞MMP-2蛋白的表达，进而促进A549及A549/DDP细胞的侵袭和转移的进程。

PI3K/Akt通路是肿瘤细胞侵袭转移的经典信号途径之一，为进一步探索PI3K/Akt通路在缺氧活化CaSR促进A549细胞侵袭的作用，我们选用了PI3K信号通路的抑制剂LY294002进行实验。结果显示，LY294002能够减弱GdCl3所引起的细胞侵袭效应，表现为细胞迁移距离减少，穿过滤膜细胞的数量减少；蛋白检测结果显示，缺氧能够增加Akt蛋白磷酸化水平，GdCl3能增强缺氧的作用，但该作用被LY294002所减弱。这些结果均提示，PI3K/Akt信号通路在缺氧活化CaSR促进A549及A549/DDP细胞侵袭中起重要作用。