人粪便中Collinsella aerofaciens菌的分离鉴定及其耐药性研究

杨 浩， 李琳琳, 韩 雪， 田滋润， 张旭华， 王 烨

(新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011)

肠道菌群与肥胖、胰岛素抵抗及2型糖尿病等代谢性疾病的发生密切相关[1-2]。本课题组前期研究表明糖耐量正常人群与2型糖尿病患者肠道菌群中红椿菌科(Coriobacteriaceae)水平存在差异性[3]。Collinsellaaerofaciens菌为Coriobacteriaceae科Collinsella菌属的细菌[4]，Collinsella菌属水平与空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数、C-肽、血清胆固醇和甘油三酯水平呈正相关，而与高密度脂蛋白胆固醇水平呈负相关，在动脉粥样硬化患者肠道中富集，在高血糖等慢性病史患者肠道中显著升高[5-8]。因此Collinsellaaerofaciens菌在肠道中丰度的改变可能与肥胖、胰岛素抵抗及2型糖尿病等代谢性疾病的发生、发展存在密切关联。本研究从粪便中分离获得Collinsellaaerofaciens菌，对其耐药性进行研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药ES-315型高压灭菌锅(日本TOMY KOGYO公司)，E200型厌氧培养箱(美国Gene Sciense公司)，P7021TP-6型微波炉(广东格兰仕集团有限公司)，VITEK-2 Compact型全自动细菌鉴定仪(法国梅里埃公司)，MyCycler型普通PCR仪(美国伯乐公司)，真杆菌选择性琼脂基础培养基(ESA培养基，招远拓普生物工程有限公司，批号12190)，无菌脱纤维羊血(北京索莱宝科技有限公司，批号20170819)，Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程有限公司，批号SK8255)，SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒(生工生物工程有限公司，批号SK8131)，麦氏比浊管(康泰生物有限公司，批号QG06)，药敏片(英国OXOID公司，批号201709)。

1.2 粪菌样本的筛选方法选取年龄20～40岁糖耐量正常人的粪菌样本。糖耐量正常的判定标准[2]：静脉血液的空腹血糖在3.9～6.1 mmol/L，或者口服糖耐量试验后2 h血糖小于7.8 mmol/L的人群为糖耐量正常人群。排除标准[9]：近3个月内有抗生素用药史、甾体类药物和微生态制剂人群；近1年发生过非创伤性感染、过敏、免疫异常疾病史；有手术及其他应急情况人群；有精神病史，滥用药物人群；排便习惯异常；有肝肾功能损害，慢性肠胃功能紊乱，有腹泻、胆道感染病史和肠炎等胃肠道疾病、血液系统或其他内分泌系统疾病人群；心理和行为学异常者；孕妇、哺乳期妇女。

1.3Collinsellaaerofaciens菌培养基的制备方法称取ESA固体培养基4.06 g，加入装有95 mL蒸馏水的锥形瓶中并混匀，放入微波炉中加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15 min，冷却至55℃，加入脱纤维羊血5 mL并轻轻混匀，避免气泡，倾倒入无菌平皿中，备用。

1.4Collinsellaaerofaciens菌的培养分离方法用无菌棒挑取糖耐量正常人清晨排便后的粪样5 g，放入无菌的密闭便盒中，1 h内送至实验室。在厌氧培养箱内，将粪样用生理盐水依次稀释至10、102、103、104、105、106、107和108倍，分别吸取200 μL，涂布平板，置于厌氧培养箱内37℃培养72 h。经反复多次分离纯化直至平板培养基呈现单一菌落，并通过菌落的形态学进行初步鉴定。

1.5 细菌鉴定方法

1.5.1 全自动细菌鉴定仪鉴定 将加脱纤维羊血ESA固体培养基上的单个细菌制备成菌悬液，并利用全自动细菌鉴定仪上的读卡器对含有菌混悬液的VITEK鉴定卡进行自动读卡，将结果打印成报告。

1.5.2 分子学鉴定 按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取ESA固体培养基上单个菌落总DNA。菌种鉴定通用引物：正向引物27F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′； 反向引物1429R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR扩增体系(25 μL)：分别加入0.5 μL Template(基因组DNA 20～50 ng/μL)，2.5 μL 10×Buffer(with Mg2+)，1 μL dNTP(各2.5 mmol/L)，0.2 μL酶，上、下游引物(10 mmol/L )0.5 μL和双蒸水至25 μL。PCR循环反应程序：94℃ 4 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min；4℃保持。1%琼脂糖电泳反应条件：150 V，100 mA，20 min，并进行电泳观察。切割PCR产物电泳条带中所需DNA的条带，按照SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒说明书对DNA目标条带进行纯化。纯化后DNA的A260/A280比值均在1.6～2.0内，该范围的比值说明DNA纯度较好，可以进行克隆测序，结果提交GenBank，并在核糖体数据库进行比对。

1.5.3 系统进化分析 将“1.5.2”项下克隆测序的结果采用MEGA6.06版本软件建立系统发育树，选用Construct/Test Neighbor-Joining Tree方法，Bootstrap Replications为1 000进行分析。

1.6Collinsellaaerofaciens菌的药敏实验

1.6.1 菌液的制备 挑取培养基上单个菌落溶于无菌生理盐水中，根据麦氏比浊管配制方法，制成0.5个麦氏单位的细菌稀释液，该细菌的浓度约为细菌数×108/mL，稀释该浓度到细菌数×106/mL，备用。

1.6.2 Kirby-Baure法 按“1.3”项下方法配制加脱纤维羊血ESA固体培养基，该培养基的颜色为红色。同法制备未加脱纤维羊血ESA固体培养基，仅在冷却至55℃时，不加脱纤维羊血，直接将培养基倾倒入无菌平皿中。取“1.6.1”项下菌液200 μL，分别用无菌棉拭子将菌液均匀涂布于平板培养基上，静置5 min。用无菌镊子取药敏片分别贴于平板培养基表面，37℃培养48 h，每种抗生素都分别在两种不同的ESA固体培养基上进行抑菌实验，并重复6次，最后用十字交叉法测量抑菌圈，计算平均抑菌圈直径和标准差。

1.6.3 药敏片的选择及药敏判断标准 选用8种不同抗生素和纸片效价，采用Kirby-Baure法进行药敏试验，通过抑菌圈直径来判定耐药、中介或敏感，见表1。

表1 药敏片种类、效价及判定标准

2 结果

2.1 菌落形态特征菌落直径1～3 mm，圆形，全缘到缺刻状，凸起，半透明或稍不透明，光滑，闪光。在加脱纤维羊血ESA固体培养基上培养、分离的单一形态菌落，见图1。

图1 Collinsella aerofaciens菌落图

2.2Collinsellaaerofaciens菌的鉴定结果全自动细菌鉴定仪显示加脱纤维羊血ESA固体培养基上培养分离的单一形态菌落为Collinsellaaerofaciens菌。

2.3Collinsellaaerofaciens菌的分子鉴定通过菌种鉴定通用引物对加脱纤维羊血ESA固体培养基上单一形态菌落进行普通PCR扩增。1%琼脂糖电泳结果显示，加脱纤维羊血ESA固体培养基上单一形态菌落的16S r RNA gene在1 500 bp呈现单一条带，说明扩增条件及效率较好。对上述单一条带回收纯化并进行克隆测序，在核糖体数据库比对，结果为Collinsellaaerofaciens菌(其中Query cover为91%， E value为0， Ident为99%)。Collinsellaaerofaciens菌的16S r RNA gene琼脂糖电泳图，见图2。

2.4 系统发育树的建立经MEGA6.06软件系统进化分析结果显示该菌落与CollinsellaaerofaciensLC258146.1菌相似度为100%，与CollinsellaspLK021115.2菌相似度为91%，从细菌的亲缘性判定送样菌落为CollinsellaaerofaciensLC258146.1菌，系统发育树见图3。

图2 Collinsella aerofaciens菌的16S rRNA gene

(注：左图为Marker梯度；右图S1-S4为固体培养基上的4个单个菌落扩增的条带；S5为Marker)

2.5 药物敏感试验Kirby-Baure法进行药敏试验发现8种药敏片在未加脱纤维羊血和加脱纤维羊血ESA固体培养基上的抑菌圈直径(mm)有所差异，见图4、5。

图3 送样菌落的系统发育树

(注：其中下图中“送样菌落”代表加脱纤维羊血ESA固体培养基上单一形态菌落)

图4 8种药敏片对生长在未加脱纤维羊血ESA固体培养基上Collinsellaaerofaciens菌的作用图

图5 8种药敏片对生长在加脱纤维羊血ESA固体

培养基上Collinsellaaerofaciens菌的作用图

2.6 8种药敏片在2种培养基中抑菌效果的比较8种药敏片中多西环素、庆大霉素、阿莫西林、头孢孟多、头孢他啶和万古霉素在未加脱纤维羊血和加脱纤维羊血的ESA固体培养基中都表现敏感，而阿奇霉素和环丙沙星则表现耐药。在未加脱纤维羊血ESA固体培养基中，抑菌圈直径：阿莫西林>头孢孟多>万古霉素>庆大霉素>多西环素>头孢他啶>阿奇霉素=环丙沙星；在加脱纤维羊血ESA固体培养基也呈现相同的结果。与未加脱纤维羊血ESA固体培养基相比，加脱纤维羊血ESA固体培养基上多西环素(t=4.053，P<0.01)、庆大霉素(t=4.568，P<0.01)、阿莫西林(t=10.826，P<0.01)和万古霉素(t=8.032，P<0.01)对Collinsellaaerofaciens菌的抑菌圈直径减小，差异有统计学意义(P<0.01)；头孢孟多(t=0.000，P>0.05)和头孢他啶(t=-1.581，P>0.05)对Collinsellaaerofaciens菌的抑菌圈直径无变化，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 8种药敏片对生长在2种不同ESA固体培养基对Collinsella aerofaciens菌的作用

注：与未加脱纤维羊血ESA固体培养基组上的抑菌直径比较，*P<0.01。

3 讨论

VITEK-2 Compact型全自动微生物鉴定药敏分析仪虽然可以快速鉴定细菌，但对于不同种类细菌检测结果一致性和准确性存在一定的差异性。VITEK-2细菌药敏检测系统中氨苄西林/舒巴坦、头孢曲松、头孢替坦、美罗培南和头孢吡肟的药敏检测结果一致性和准确性较低,其他抗菌药物的药敏结果均具有很好的一致性和较高的准确性[10]。16S rRNA 广泛存在于原核生物的细胞中，保留了大量的信息量又便于扩增和测序，利用恒定区序列的引物将16S rRNA gene序列扩增出来，可再利用可变区序列的差异对不同属、种的细菌进行分类鉴定[11]。本研究采用16S rRNA gene序列测序分析，所得结果同样是Collinsellaaerofaciens菌。本研究2种鉴定方法获得一致结果说明VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定仪对Collinsellaaerofaciens菌鉴定具有一定的准确性。

本实验采用Kirby-Baure法，结果显示与未加脱纤维羊血ESA固体培养基(呈现透明淡黄色)相比，加脱纤维羊血ESA固体培养基(呈现红色)对抑菌圈的观察和测量没有影响。加脱纤维羊血目的是增加ESA固体培养基营养的丰富性，有助于细菌的生长。加脱纤维羊血ESA固体培养基上的菌苔生长更加密集并且均匀，而未加脱纤维羊血ESA固体培养基上的菌苔较为不均匀。

有研究发现对抗PD-1免疫疗法有响应的转移性黑色素瘤患者肠道中Bifidobacteriumlongum,Collinsellaaerofaciens和Enterococcusfaecium更为丰富，将上述患者粪菌植入无菌小鼠体内，可增强T细胞应答，可增强抗PD-1疗法的效力，因而对肿瘤有着更好的控制[12-14]。Collinsellaaerofaciens菌的相对丰度在肝细胞癌患者粪便中显著增加[15]。Collinsellaaerofaciens菌在不同疾病中扮演着不同的角色，当Collinsellaaerofaciens菌有益于改善疾病时，可以充分发挥其缓解或治疗疾病的作用,当该菌诱发或增加某些疾病的发生、发展时，可以通过抗生素对该菌进行干预，使其在肠道菌群中的丰度水平降低。本研究发现多西环素、庆大霉素、阿莫西林、头孢孟多、头孢他啶和万古霉素对Collinsellaaerofaciens菌具有抑制作用。