7种干果组合对AD模型大鼠行为学及氧化应激水平的影响

满福通·阿不都色麦提， 黄瑞忠， 张洋弋， 肖 辉， 李 雪， 艾扎提古丽·卡的尔，

(1新疆医科大学公共卫生学院 营养与食品卫生学教研室, 乌鲁木齐 830011; 2温州锡安营养保健食品有限公司, 浙江 温州 325000)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一种导致记忆、认知和行为能力不可逆障碍, 且逐渐恶化的神经系统疾病。AD患者脑海马区出现β-淀粉样蛋白(Aβ)的异常增多集合而形成老年斑(SP)，神经元的缠结、凋亡等恶性病变，Aβ会导致神经胶质增生、炎症反应、氧化损伤神经元，这些病变会影响机体学习、记忆能力。研究证实抗氧化剂可使机体自由基清除能力增强, 降低Aβ对神经元的损伤, 从而改善AD患者的症状和延缓其病情的发展[1-2]。

根据新疆地产7种特色干、坚果包括：核桃、巴旦杏、腰果、葡萄干、红枣、圣女果、黑加仑的抗氧化组分，按一定比例研制具有抗氧化功效的干果包。本实验将该干果包配方按不同浓度加入到大鼠饲料中制出不同含量的特殊饲料，通过饲喂的方式干预用Aβ25-35建立的AD模型大鼠，检测该干果包配方对其学习能力、记忆功能的改变, 研究该干果组合抗AD的功效以及可能的机制。

1 实验动物与材料

1.1 动物分组及干预清洁级SD大鼠65只，8～9周龄，新疆医科大学动物中心提供，实验动物使用许可证编号：SYXK2018-0003。 将所有大鼠编号，按照随机数表将其随机分为5组(13只/组)：假手术对照组(该组造模时注射灭菌生理盐水)、模型对照组、其余3个组分别为低(10%)、中(15%)、高(20%)浓度干果饲料组; 除假手术对照组外的52只大鼠全部进行造模手术。

干预: 造模后第7天, 开始饲料干预。假手术对照、模型对照组给予正常大鼠饲料, 干果饲料组分别给予相应浓度的饲料。其余所有条件一致。每24小时饲料用量为5 g/100 g, 连续饲喂干预40 d[3]。

1.2 试剂及仪器试剂: Aβ25-35(Sigma公司); 酶联反应吸咐实验(ELISA)试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司[批号: MDA(CK-E30239), SOD(CK-E30259), CAT(CK-E30417)]。仪器: 脑立体定位仪(德国TSE Systems型号: 540060); 微型漩涡混合仪(长沙平凡仪器仪表有限公司, 型号:WH.1); Morris水迷宫视频跟踪分析系统(成都泰盟科技有限公司); 组织匀浆机(德国IKA公司, 型号: Ltra-Turraxt 8型); 酶标仪(芬兰Labsysten公司, 型号: MK3型)。

1.3 实验方法

1.3.1 饲料制备 将初步处理过的原料(干果、坚果)粉碎, 过筛(80目)备用; 按比例将原料粉加入漩涡混匀器混匀。根据《中国居民膳食指南(2016)版》中坚果、干果每日摄入量[4]设计出各组相应的干果饲料浓度: 低浓度组(10%)、中浓度组(15%)、高浓度组(20%)。将之前混匀的原料粉按比例加入到各组特殊饲料中,进行干燥、灭菌处理。

1.3.2 造模 造模剂制备:灭菌生理盐水配置10 μg/μL Aβ25-35溶液, 存放在37 ℃恒温箱7 d, 孵化其成为聚集状态后存于4 ℃冰箱中备用。适应性饲养72 h后进行造模(术前12 h禁食)。将大鼠用3.0%戊巴比妥钠(40 mg/kg)进行麻醉后将大鼠固定, 根据脑立体定位图谱[3]精确标记双侧脑海马CA1区位置并钻孔, 用微量进样器逐个注射5 μL Aβ25-35溶液(假手术对照组则使用等量的灭菌生理盐水代替Aβ25-35溶液), 留针3～5 min后缓慢拔出针头, 消毒并缝合。

1.3.3 Morris水迷宫实验 定向航行实验从饲喂第35天开始进行5 d，测试大鼠的学习和记忆能力的改变。实验开始时, 从一、二、四象限中随机选一个，从边缘1/2处将大鼠头朝水池壁放入水中，用水迷宫分析仪记录各项指标。空间探索实验于水迷宫实验第6天开始, 在电脑中标记隐蔽于第三象限的原有逃生平台位置, 撤去平台, 入水点为第一象限1/2处(平台象限对角), 其余步骤与定向航行实验一致。

1.3.4 氧化应激实验 空间探索实验结束后进行组织采样, 腹腔注射10%水合氯醛麻醉后, 将大鼠剖腹，取适量的腹主动脉血, 离心20 min(2 000 r/min), 取上清液; 随后将其断头取脑, 小心分离海马组织, 加入9倍冷生理盐水(9%)并进行冰上匀浆, 低温离心15 min(3 500 r/min), 分离上清液, 将血清与海马匀浆样本冻存于-80℃冰箱备用。ELISA试剂盒的说明书, 测定血清以及海马组织中的超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量[5]。

2 结果

2.1 各组大鼠Morris水迷宫实验结果比较

2.1.1 定向航行实验结果 与假手术对照组比较，模型对照组潜伏期变长，朝向角变大，目标象限进入次数减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，随饲料中干果含量的增加，低、中、高浓度组潜伏期时间减小，朝向角减小，目标象限进入次数增加；且高浓度组与模型对照组比较潜伏期减小，朝向角减小，目标象限进入增大次数，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.1.2 空间探索实验结果 与假手术对照组比较，模型对照组大鼠潜伏期增加，原平台象限滞留时间减小，且差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比，干果饲料组，随饲料中干果含量增加，潜伏期增加、原平台象限滞留时间、穿越次数(除中浓度组)逐渐增加。高浓度组潜伏期、原平台象限滞留时间、原区域穿越次数与模型对照组差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 各组大鼠Morris水迷宫定向航行实验结果比较

注： 与假手术对照组比较,*P<0.05; 与模型对照组比较:ΔP<0.05。

表2 各组大鼠Morris水迷宫空间探索实验结果比较

注：与假手术对照组比较,*P<0.05; 与模型对照组比较,ΔP<0.05。

2.2 氧化应激实验结果与假手术对照组比较，模型对照组血清、海马匀浆中SOD和CAT含量均减少,MDA含量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较，高浓度组大鼠血清与海马中的CAT含量增加，MDA含量减少，差异有统计学意义(P<0.05)。随着饲料中干果含量的增加，海马、血清中SOD、CAT含量呈上升趋势，MDA则是下降趋势，见表3。

表3 各组大鼠血清与海马组织匀浆中SOD、CAT和MDA的含量结果比较

注：与假手术对照组比较,*P<0.05; 与模型对照组比较,ΔP<0.05。

3 讨论

本实验结果表明，与假手术对照组比较，在Morris水迷宫实验的定向航行实验与空间探索实验中测得模型对照组大鼠潜伏期和朝向角均增加，目标象限进入次数则减少，Morris水迷宫实验是常用的检验学习、记忆功能改变的行为学实验[6], 尤其在AD这类认知能力减退的疾病研究中应用较多[7]。定向航行实验可检测大鼠学习能力的改变，实验中造模手术后模型对照组大鼠比正常大鼠反应变慢，学习能力降低。空间探索实验可以检测造模前后大鼠记忆功能的改变。模型对照组海马区注射了Aβ25-35，Aβ可形成老年斑(SP)，神经元的缠结、凋亡等病变[8]，Aβ会导致神经胶质增生、炎症反应、氧化损伤神经元，影响机体学习、记忆能力[9-11], 上述结果表明造模后的大鼠学习能力下降、记忆功能减退。表明本研究中的AD大鼠模型建立成功。

活性氧簇(reactiveoxygen species，ROS)对人体内细胞组分的过度氧化称为氧化应激[12]。许多疾病的发展跟氧化应激有关，适当的抗氧化治疗可能有助于减慢或预防AD等慢性疾病的病情进展。SOD、CAT和MDA是反映体内氧化应激水平的重要指标。超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)是体内重要的抗氧化酶[13]，其主要作用是清除自由基，与衰老和死亡密切相关。在整个的生物体抗氧化系统中，SOD和CAT占据了很重要的位置。丙二醛(MDA)是体内脂质氧化的终末代谢产物。MDA含量可反应脂质氧化的水平，也可间接反映机体受ROS攻击的程度。本实验结果显示，与假手术对照组比较，模型对照组大鼠血清和海马匀浆中SOD、CAT含量减少，MDA含量增加，表明造模后，大鼠体内的氧化应激能力降低。给各组大鼠加入干过饲料后，与模型对照组比较，干过饲料组大鼠血清、海马组织匀浆中的SOD和CAT含量均有所增加，而MDA含量则明显减少。由此说明干果饲料的干预使AD大鼠的氧化应激能力有所提高。

新疆因其特殊的地理、气候条件, 盛产大枣、核桃、葡萄干、巴旦杏等多种干果、坚果。Yang等[14]研究发现, 核桃含大量的不饱和脂肪酸、维生素、酚类、黄酮类等抗氧化活性成分, 尤其是核仁，具有高达60%的不饱和脂肪酸含量。不饱和脂肪酸对婴儿的生长发育至关重要, 尤其有助于智力的发展。实验表明, 加入花生四烯酸(一种不饱和脂肪酸)的奶粉喂养的婴儿比食用一般奶粉的婴儿抵抗力更高, 生长发育状况也更健康迅速[15]。Asadi-Shekaari等[15]用核桃干预孕期鼠的实验结果也表明,核桃中不饱和脂肪酸可以促进胎儿的大脑发育, 有助于提高子代学习记忆能力。葡萄属于脂肪酸含量较丰富的水果, 尤其是葡萄籽，研究发现葡萄含丰富的亚油酸等多不饱和脂肪酸, 其含量达总脂肪酸含量的47.80%～60.74%。葡萄还含有大量的维生素C和维生素E，维生素E具有很强的还原性、自由基清除能力, 可通过增强机体氧化应激能力达到抗氧化、抗衰老的效果[16]。大枣和巴旦杏[17]也含有大量的还原性维生素, 大枣的枣皮和枣肉中提取出的维生素C可与其果实中的酚类化合物结合, 对1,1-二苯基-2-3硝基苯肼(DPPH)自由基具有十分强劲的清除能力[18-19]。盛产于新疆南部的巴旦杏(又称扁桃仁), 其不饱和脂肪酸含量占总脂肪酸的85%，巴旦杏仁也是优质的维生素E补充剂, 研究表明用巴旦杏水提物干预脑组织样本, 脑组织样本中的SOD含量升高, LPO含量则降低, 证实了巴旦杏的抗氧化功效[20]。本研究选用的七种干果组合中富含不饱和脂肪酸、亚油酸、维生素C和维生素E等抗氧化组分，可能是其增强AD大鼠的抗氧化功能，保护脑神经元，改善学习、记忆的物质基础。