缓压乐复方制剂干预对应激性高血压大鼠血浆醛固酮的调节作用研究

楚岚鹏， 吴桂霞， 钟 莉， 卡思木江·阿西木江， 纳菲沙·卡德尔， 库热西·玉努斯

(新疆医科大学1基础医学院, 2维吾尔医学院, 乌鲁木齐 830011)

《中国心血管病报告2017》指出[1]，我国约有2.9亿心血管病患者，其中有90%以上的人患高血压，并且高血压人群各种并发症的发生率、致残率及致死率均高于其他国家。应激因素已被公认为引起高血压最主要的危险因素之一[2]。醛固酮不仅是主要的应激指标之一，而且是血管容量和血压的主要调节物质，醛固酮的生成由醛固酮合酶(aldosterone synthase,CYP11B2)的含量所决定[3],Cyp11b2基因的转录活性的调节可以依赖活化的环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cyclic adenosi ne monophosphate response element binding protein,CREB)[4]，并且CREB的活性可被蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)磷酸化后增强[5]，有文献报道，肾上腺皮质中的CREB在应激环境下磷酸化后可结合Cyp11b2基因启动子上的顺式作用元件CRE，从而增强其转录活性使醛固酮合成量增加[6]。而应激不仅使醛固酮、皮质醇等激素的分泌量增加，也可引起交感神经亢奋释放，如肾上腺素与去甲肾上腺素等儿茶酚胺类物质，促进高血压的发生发展。当前，有效地治疗高血压存在诸多困难，如何通过适宜的干预措施，降低高血压发病率与死亡率，已经成为一亟待解决的问题[7]。因此，本研究通过检测药物干预组大鼠血浆醛固酮及血清肾上腺素含量的变化，肾上腺组织Creb、Cyp11b2 mRNA表达和CREB磷酸化、CYP11B2蛋白表达水平的变化，探讨缓压乐复方制剂对SIH大鼠血浆醛固酮含量的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、实验试剂、仪器

1.1.1 实验动物 从新疆医科大学实验动物中心购买SPF级别70只雄性Wistar大鼠，体质量(200±20)g，将20只造模成功的大鼠采用完全随机分组的方法分为阴性对照组与药物干预组各10只。

1.1.2 实验试剂 大鼠醛固酮125I放射免疫分析试剂盒(北方生物研究所)，SYBR Green Mix定量试剂盒(聚合美，北京)，苏木素染液(美轩生物，上海)，大鼠肾上腺素酶联免疫法(ELISA)试剂盒(江莱生物，上海)，反转录第一链合成试剂盒(塞默飞,美国)，RNA提取Trizol试剂(Life，美国)，SV-兔抗两步法试剂盒(武汉博士德生物)，DAB显色剂(中杉金桥)，中性树胶(源叶生物，上海)，p-CREB单克隆兔抗(博奥森，上海)，CYP11B2多克隆兔抗(Ancolon，美国)，分析纯二甲苯(天津市福辰化学试剂厂)，无水乙醇(天津市福辰化学试剂厂)。

1.1.3 仪器 智能恒温电热套(上海凌托设备有限公司)，凝胶成像仪(BIO RAD-XR+)，多头旋转蒸发仪(上海力辰仪器有限公司)，荧光定量PCR仪(Applied Biosystems 7500，美国)，全波长酶标仪(塞默飞，美国)，荧光倒置显微镜(蔡司，Axiconam 1)，粉碎仪(SEIKO/精工，山东曲阜鼎达机械有限公司)，4℃低温离心机(美国BackMan)，无创型号BP-600A测血压仪器(四川成都泰盟科技有限公司)。

1.2 药物主要成分缓压乐复方制剂主要的药物成分有玫瑰花、小茴香、倒提壶、赤芍、蜀葵子等。

1.3 药物干预大鼠模型的建立大鼠在SPF级别的环境下，60%～80%的相对湿度及(25±3)℃进行1周的适应期的喂养。随机分组，采用声光、足底电刺激方法间断性对SIH模型组大鼠进行持续12周的刺激，同时正常组不做刺激并给予正常喂养。期间进行血压的测量，并在应激12周后鉴定SIH大鼠模型[8]。对一部分造模成功的SIH模型大鼠按随机方法分为阴性对照组(n=10)和药物干预组(n=10)，阴性对照组大鼠每天施以蒸馏水(1 mL/100 g体质量)灌胃干预4周，药物干预组大鼠每天施以缓压乐复方制剂(1 mL/100 g体质量)灌胃干预4周，干预期间同时施予间断足底声光电刺激，并对大鼠血压每周测量一次，4周干预结束后，处理标本。

1.4 药物干预大鼠动脉血压的测定及标本采集用缓压乐复方制剂干预4周后，使用3%戊巴比妥钠按剂量(0.1 mL/100 g体质量)腹腔注射，对麻醉的大鼠进行颈总动脉插管及血压测量。从腹主动脉按需抽取血，离心后，将所得血浆和血清以200 μL为基础分装于EP管冻存；动物处死后，取完整的肾上腺组织，一部分浸泡于4%多聚甲醛液固定，用于HE染色及免疫组化实验，剩余部分用锡纸包住保存于低温-80℃冰箱用于后续分子实验。

1.5 药物干预大鼠血浆醛固酮与血清肾上腺素含量的测定血浆醛固酮含量的测定采用125I放射免疫分析法测定，血清肾上腺素含量的测定使用ELISA方法，这两种实验的操作标准以说明书步骤为主。

1.6 药物干预大鼠肾上腺组织Creb、Cyp11b2基因mRNA的表达水平的检测将储存于-80℃冰箱的所需组织在液氮环境中研碎，倒入细胞裂解液1 mL Trizol中混匀，后经离心、加氯仿、异丙醇等有机试剂开始对总RNA进行提取，利用凝胶成像方法对RNA鉴定完成后，取1 μg RNA，按照逆转录试剂盒步骤进行。取稀释好的cDNA 1 μL作为模板进行最后的RT-qCR实验，每管都是20 μL的反应体积量，北京聚合美荧光定量试剂三步法：95℃1 min预变性过程，95℃15 s变性过程，15 s退火过程，72℃45 s延伸过程，共需要40个循环。mRNA定量采用2-ΔΔCT法，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，ΔΔCt=ΔCt(药物治疗组)-ΔCt(阴性对照组)。实验中各引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物列表

1.7 药物干预大鼠肾上腺组织CREB磷酸化及CYP11B2蛋白表达水平的检测切片经72℃烤箱中烘烤后，进行脱蜡及不同浓度酒精脱水，将切片放入湿盒中，滴加3%的H2O2(需即配即用)去除组织内源性酶，组织切片抗原修复，加入柠檬酸钠液中低火预热高火煮沸约20 min，采用5%的封闭液封闭，滴加事前摸好浓度的一抗，4℃冰箱过夜与目标抗原结合；第2天，采用盐酸吐温缓冲液(PBST)漂洗，滴加山羊抗兔IgG类型二抗，在37℃温箱环境下孵育30 min后，洗二抗，并在显微镜下控制时间用(DAB)试剂显色，自来水下洗去DAB，细胞核用苏木素液染色，1%盐酸酒精分化液分化，自来水返蓝，再进行酒精Ⅰ与Ⅱ的复水及二甲苯Ⅰ与Ⅱ的透明过程，最后滴加中性树胶，用盖玻片封片，室温下晾干。使用荧光倒置显微镜进行免疫组化采图拍照，每只大鼠每次拍照随机选取4～5个视野。免疫组化使用Image ProPlus 6.0(Media Cybernetics)软件采图并分析处理，计算出的阳性染色面积代表候选蛋白的表达水平，结果取4～5个视野阳性面积的平均值。

2 结果

2.1 大鼠每周血压的变化给予蒸馏水和缓压乐复方制剂干预后2组大鼠每周血压的变化，与阴性对照组比较，收缩压与舒张压在13、14、15周时，与阴性对照组相比，药物干预组大鼠收缩压与舒张压变化不明显(P>0.05)，干预至16周末时，药物干预组大鼠收缩压与舒张压表现为明显降低(P<0.05)，见表2。

2.2 大鼠血浆醛固酮和血清肾上腺素含量变化与阴性对照组比较，药物治疗组大鼠血浆醛固酮含量明显下降(P<0.05)，血清中肾上腺素的含量无明显变化(P>0.05)，见表3。

表2 大鼠收缩压与舒张压的变化

表3 大鼠血清肾上腺素含量变化

2.3 大鼠肾上腺组织Creb、Cyp11b2基因mRNA表达量的变化与阴性对照组比较，药物干预组大鼠肾上腺组织Creb基因mRNA表达水平明显下调(P<0.05)，Cyp11b2基因mRNA表达水平明显下调(P<0.05)，见表4。

表4 大鼠肾上腺组织Creb、Cyp11b2基因mRNA 表达量的变化

2.4 大鼠肾上腺组织CREB磷酸化及CYP11B2蛋白表达水平变化免疫组织化学染色的结果显示，CREB在肾上腺组织中的阳性表达产物为棕黄色，在药物干预组大鼠肾上腺皮质球状带细胞核染色面积较小，而在阴性对照组大鼠肾上腺皮质球状带细胞表现为核染且核染面积大，2组CREB蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05)；CYP11B2在肾上腺组织中的阳性表达产物为棕黄色，在药物干预组大鼠肾上腺皮质球状带细胞胞浆中染色较浅、面积小，而在阴性对照组大鼠肾上腺皮质球状带细胞胞浆染色深、面积大，2组CYP11B2蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05)，见表5、图1。

表5 大鼠肾上腺组织CREB磷酸化水平及CYP11B2蛋白 表达水平变化

3 讨论

我国心脑血管疾病导致的死亡率逐年呈明显上升态势，其中高血压是首位危险因素[9]。大量流行病学研究已证明应激是高血压发病的一个主要原因，并对高血压发生发展起着始动、维持作用[10]。与发达国家比较，我国居民患高血压的人数虽多，但高血压的干预率和控制率较低[11]，因此，如何采取一个合理的方案控制血压具有重要意义。

CYP11B2是合成醛固酮反应步骤中的限速酶，属于线粒体细胞色素P450酶系超家族的一员，其通过对底物18-羟皮质酮的催化生成醛固酮[12]，在合成醛固酮的过程中具有重要意义。Cyp11b2的转录活性受多种因素的影响，应激发生时，交感神经处于激活状态时会释放大量的肾上腺素，肾上腺素可以激活PKA[13]，使转录因子CREB磷酸化进而增强Cyp11b2基因的转录活性。CREB是真核细胞核内转录因子，属转录因子亮氨酸拉链家族中的一员，它在基因转录的调节中起关键作用[14]。在CREB含有的功能区中—转录激活结构域，包括一段α-多肽序列及谷氨酸密集区，是位于CREB的101～144位点，又被称为激酶诱导区(kinase-induced domain,KID)[15]，其中包含多种蛋白激酶PKA、PKC等的磷酸化位点。研究表明[16]，磷酸化的CREB具有比非磷酸化CREB强约20倍的增强靶基因Cyp11b2转录活性的作用。缓压乐复方制剂是以小茴香、倒提壶等中草药为配方的复方制剂。在本研究中，药物干预组大鼠血清肾上腺素含量没有明显降低。而肾上腺组织Creb基因mRNA表达量及其蛋白磷酸化水平、Cyp11b2基因mRNA及其蛋白表达水平和血浆醛固酮含量均明显下调。因药物干预组大鼠血清肾上腺素含量没有发生明显变化，PKA仍处于激活状态，而下游转录因子CREB活性、Cyp11b2基因mRNA及其蛋白表达水平和血浆醛固酮含量均明显下调，所以我们认为在应激性高血压大鼠模型中，CREB蛋白磷酸化可能还受其它激酶的调节，但具体机制还有待进一步研究。而在药物干预模型中，CREB的活性的下调是醛固酮合成关键酶Cyp11b2转录活性、血浆醛固酮含量及血压降低的主要原因之一。

综上所述，应激性高血压大鼠模型中CREB蛋白磷酸化可能还受其它激酶调节，而CREB的活性的下调是缓压乐复方制剂干预模型中醛固酮合成关键酶Cyp11b2转录活性、血浆醛固酮含量及血压降低的主要原因之一。