磁性氧化石墨烯固相萃取-超高效液相色谱/质谱法测定环境水体中微囊藻毒素

刘小燕， 李欣悦， 高仕谦，2， 蒋刘婧， 张占恩，2， 张丽君*，2

(1.苏州科技大学环境科学与工程学院，江苏苏州 215000; 2.苏州科技大学环境与工程重点实验室，江苏苏州 215000 3.南京大学环境学院，江苏南京 210000)

随着社会生活及工业化进程的迅速发展，大量含有氮、磷元素的污染物通过地表径流和排污管网等方式进入环境水体，导致水体富营养化，使得某些藻类物质会在水体中快速增长繁殖，产生水华，释放微囊藻毒素(Microcystins,MCs)等有害物质[1 - 2]，对人们健康构成重大威胁。世界卫生组织和我国饮用水卫生规范皆规定，饮用水中的MCs浓度不得高于1.0 μg/L[3]。因此，建立水中MCs检测方法具有极其重要的意义。

当前，环境水体中MCs的检测多采用高效液相色谱-串联质谱法[4 - 5]。而前处理方法主要有固相萃取[6 - 9]、固相微萃取[10]、磁性微萃取[11]、加速溶剂萃取[12]等。近年来，磁固相萃取(Magnetic Solid Phase Extraction,MSPE)[13]技术逐渐兴起，该技术具有便捷操作简单、分离，在复杂基质体系中易于分离等优点。氧化石墨烯(GO)具有较大比表面积[14 - 15]，对一些环境污染物具有高吸附性。本研究采用一步合成法合成磁性氧化石墨烯(MGO)，并将其用作磁固相萃取材料对环境水体中的MCs进行分离富集，结合超高效液相色谱-质谱法(UPLC/MS)进行分析测定。该检测方法灵敏度较优，检出限理想，为MCs的分析测定提供简单快捷的测试方法。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

TSQ Quantum Ultra EMR三重四极杆质谱仪、Ultimate 3000高效液相色谱仪、Quanta FEG 250扫描电子显微镜(美国，FEI公司)；Nicolet-6700傅里叶变换红外光谱仪(美国，Thermo公司)；VD115真空干燥箱(德国，Binder公司)；KQ-300VDE型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；Milli-Q Academic超纯水净化器(美国，Millipore公司)；JJ-1精密增力电动搅拌器、SK-1快速混匀器(金坛市科析仪器有限公司)；HY-2调速多用振荡器(苏州威尔实验用品有限公司)；DC-12型氮吹仪(上海安普公司)。

MC-LR、MC-RR标准品(纯度≥98%，美国O2Si公司)，采用色谱纯甲醇分别配制100.0 μg/mL的单标准储备溶液，于-20 ℃储存，使用时用甲醇稀释为1.0 μg/mL的工作溶液。氧化石墨烯(GO)粉末的纯度为99%，单层率≥96%(济宁利特纳米技术有限责任公司)；FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、丙酮、甲酸、冰乙酸、无水乙醇(分析纯，国药集团)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；甲酸(色谱纯，阿拉丁生化科技股份有限公司)。实验用水由Milli-Q纯水净化器(美国Millipore公司)制备。

1.2 实验方法

1.2.1 磁性纳米材料的合成称取1.0 g GO于200 mL超纯水中，均匀搅拌后，超声2 h。称取2.716 g FeCl3·6H2O溶于200 mL超纯水中，再加入1.675 g FeSO4·7H2O搅拌溶解。将溶液移至四颈烧瓶中，在室温下匀速搅拌1 h，使其充分混合。再在高纯氮气保护下，80 ℃水浴、搅拌状态下将GO悬浮液加入上述溶液中，逐滴加入10 mL氨水，反应1 h，随后将水浴温度降至50 ℃继续搅拌反应1 h。最终得到深褐色沉淀物，用超纯水和无水乙醇交替各洗涤3次后，过滤，滤渣于60 ℃真空干燥12 h，研磨后得到2.5403 g GO -Fe3O4，即MGO粉末。

1.2.2 样品前处理准确称取10.0 mg MGO至含有1.0 μg/L MC-LR和MC-RR的100 mL水样中，调节溶液pH至4.0，振荡吸附15 min，而后磁分离，倾去上清液，水分除尽，加入1.5 mL含0.1%甲酸甲醇，涡旋解吸1.5 min，经0.22 μm有机滤膜滤于10 mL离心管中，如此重复解吸2次。氮气挥干溶剂，采用1 mL初始流动相溶解后，进行UPLC/MS分析测试。

1.2.3 色谱/质谱条件Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(50×3.0 mm，1.8 μm)；流动相：甲醇(A)和0.1%甲酸水溶液(B)。梯度洗脱程序如下：0～3.0 min，5%～95%A；3.0～4.5 min,95%～100%A；4.5～5.0 min，100%A；5.0～5.1 min，100%～5%A；5.1～8 min，5%A；流速：0.4 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。电喷雾电离，正离子模式(ESI+)；选择反应模式(SRM)监测；传输管温度：350 ℃；喷雾温度：300 ℃；喷雾电压：3 500 V；鞘气压力：35 MPa；辅助气压力：15 MPa；SRM模式的参数如表1所示。

表1 MC-LR和MC-RR的保留时间、母离子、子离子和碰撞能量

Notes:*Quantitativeion.

2 结果和讨论

2.1 材料合成的过程分析

采用扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)和傅里叶变换红外(FT-IR)光谱表征材料的结构形貌。图1a是GO的SEM图，图1b是MGO的SEM图，图1c和1d是MGO的TEM图。由图可知GO的表面有大量褶皱，比表面积大，形成的Fe3O4大量附着在点位上，在外加磁场作用下，MGO可有效地与基质分离。

图1 GO(a)和MGO(b)扫描电镜(TEM)及MGO(c，d)的透射电镜(TEM)图Fig.1 SEM images of GO(a),MGO(b) and TEM images of MGO(c,d)

图2为MGO的IR光谱谱图，3 423 cm-1处是MGO的水分子的O-H吸收峰，1 577 cm-1处是羧基中C=O 的吸收峰，1 460 cm-1处的吸收峰是COO-的伸缩振动，1 324 cm-1处是C-O-C的吸收峰，622 cm-1处是Fe-O的吸收峰值，为Fe3O4的特征峰。

此外，还对MGO材料进行了比表面积(BET)、孔径分布(BJH)和磁滞回线分析。结果表明，材料BET是115.9 m2/g，孔体积是 0.144 cm3/g，孔径是8.375 nm。由图3可知，磁性强度是49.2 emu/g。数据表明，Fe3O4成功负载到石墨烯材料上。

图2 MGO的红外(IR)光谱图Fig.2 IR spectra of MGO

图3 MGO的磁滞回线图Fig.3 Magnetic hysteresis loop of MGO

2.2 磁固相萃取条件的优化

2.2.1 MGO用量的选择在前处理过程中，吸附剂用量是一个重要考察因素。如图4所示，当MGO由2.0 mg增大至10.0 mg时，萃取效率逐步提高，而吸附剂用量由10.0 mg 持续增大至12.0 mg 时，效率略有降低。因此将MGO的加入量定为10.0 mg。

2.2.2 水样pH值及离子强度的影响溶液的pH可以对MGO与目标物表面电荷分布产生作用。实验选取pH值范围为2.0～12.0进行分析，结果如图5。2种目标MCs在pH值为4.0时吸附效果最佳。这是由于MGO表面带有大量的正电荷，在酸性条件下，MGO对目标物分子具有更理想的萃取效果，而随着溶液pH值的升高，MGO表面正电荷的数目减少，静电力的削弱致使其对目标物的吸附效率随之减小。

图4 MGO用量对萃取效率的影响Fig.4 Effect of MGO amount on extraction efficiency

图5 pH值对萃取效率的影响Fig.5 Effect of pH on extraction efficiency

本实验向水溶液中加入一定量的NaCl，以调节水样的离子强度，选取水样中NaCl浓度范围为0%～25%。实验结果表明，水样中NaCl的浓度越高，吸附效率却随之减小，所以不需要调节水样的离子强度。

2.2.3 吸附时间的优化实验选取萃取时间为0、5、10、15、20、25、30 min，结果表明当萃取时间延长至15 min时，萃取效率逐渐提高；当萃取时间由15 min增大至30 min时反而导致了萃取效率的降低。为了保证较好萃取效率，所以选取15 min 为后续实验的吸附时间。

2.2.4 洗脱剂条件的优化本实验中考察了甲醇(含0.1%甲酸)、甲醇、乙腈、丙酮和二氯甲烷对于目标物洗脱效率的影响。结果表明，丙酮、二氯甲烷和乙腈均不能有效地将目标物MC-LR和MC-RR从纳米材料表面洗脱，而含0.1%甲酸甲醇洗脱效果较好。实验分别采用2.0 mL的含0.1%甲酸甲醇洗脱两次，3.0 mL的含0.1%甲酸甲醇洗脱三次，3.0 mL的含0.1%甲酸甲醇洗脱两次，5.0 mL的含0.1%甲酸甲醇洗脱两次。结果表明，MC-RR的洗脱效率在2.0 mL含0.1%甲酸甲醇洗脱两次，3.0 mL含0.1%甲酸甲醇洗脱三次，3.0 mL含0.1%甲酸甲醇洗脱两次时逐步增大，5.0 mL含0.1%甲酸甲醇洗脱两次时略有降低；MC-LR的洗脱效率在逐步增大。本实验选择3.0 mL洗脱两次进行后续处理。

综上结果，优化萃取和洗脱条件为：磁性氧化石墨烯的称取量10.0 mg，水样pH为4.0，振荡时间选取15 min，含0.1%甲酸甲醇为洗脱剂，用量为3.0 mL洗脱两次，洗脱3 min。

2.3 方法的评估

配制MC-LR和MC-RR浓度为0.05～1.0 μg/L，体积为100 mL模拟试液，经MGO萃取后经由UPLC/MS检测，MC-LR与MC-RR的浓度与色谱峰面积线性关系都较好。向超纯水中加入MCs标液，使水样中目标物浓度均为1.0 μg/L，分别于1 d内及连续3 d分析测定，各测定5个平行样，计算得到相对标准偏差(RSD)。结果如表2所示。

表2 MC-LR和MC-RR的线性方程、线性范围、相关系数(r)和精密度

2.4 实际水样的测定

采集太湖三个点位(漫山、渔洋山、太湖北)的实际环境水样，经0.45 μm滤膜过滤后，加入MCs标准品，使其浓度分别为0.05 μg/L和0.50 μg/L，在本文优化条件下测定，结果如表3。数据显示，太湖北的水样中检测到少量的 MC-RR，漫山点位水样的加标回收率均处于89.9%～102.7%范围内，RSD不超过7.5%；渔洋山点位水样2种MCs的回收率为84.3%～109.1%，RSD不超过7.8%；太湖北点位水样的回收率处于89.6%～108.6%，RSD不超过 9.3%。可以看出，本方法的重现性良好，精密度较高，可以应用于实际水样中MCs的测定。

表3 太湖水样中MCs的回收率和相对标准偏差(n=5)

ND:not detected.

3 结论

本研究探究以磁性氧化石墨烯作为萃取材料，分离富集水样中MC-LR和MC-RR。水中目标污染物在痕量级别(1.0 μg/L[3])可以用这种方法进行分离分析。这一方法操作时间短、重现性好、检测限低、目标物质的萃取效率高，适用于检测水体中的痕量微囊藻毒素。