气相色谱-质谱的代谢组学方法研究血必净注射液对百草枯中毒大鼠的治疗作用

李 莎， 祝益民， 刘 文*,， 伍洋科， 蒋菲娅， 颜 笑

(1.湖南师范大学医学院，湖南长沙 410013；2.湖南省人民医院药学部，湖南长沙 410005；3.危急重症代谢组学湖南省重点实验室，湖南长沙 410005)

百草枯(Paraquat，PQ)是在农业生产中广泛应用的非选择性、接触性、低污染、低残留的一种广谱高效除草剂。它不仅对植物有毒，对人类和动物也有很大的毒性[1 - 2]。摄入超过20 mL的20%PQ水剂会导致全身炎症反应、多器官衰竭和心源性休克而致死；摄入较小的剂量也会导致死亡，但过程较慢可能需要数周时间，并且由过度和不可逆转的肺纤维化和肾衰竭发生而致死[3]。PQ患者中毒后会累及多器官损伤，其中肺是百草枯的主要毒性靶标；PQ中毒引起的肺损伤最初表现为急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征，随后发展为广泛的纤维化[4]。目前临床上主要治疗手段是血液灌注、血液透析，合用免疫调节、抗氧化治疗[5]，但是由于百草枯固有的毒性以及缺乏特效解毒剂，其预后致死率依然很高。

血必净注射液(XBJ)是一种从赤芍、川芎、丹参、红花和当归5味中草药中提取的中药制剂，它具有清除氧自由基、保护血管内皮、抗炎性介质、拮抗内毒素等作用，主要用于治疗与炎症有关的间质性疾病[6]。血必净联合血液灌注治疗百草枯中毒有助于改善患者器官功能障碍并阻止肺纤维化的发生，从而降低死亡率[7]，这在一定程度上表明当机体暴露于百草枯后，血必净注射液联合其他治疗手段可以对机体起到一定的保护作用，但并不能直观、全面的评价血必净的治疗效果。

代谢组学(Metabolomics)作为系统生物学研究的前沿技术和方法，通过识别生命系统中全部生物化学变化的代谢特征，为我们提供了一个了解疾病和药物作用的新视角，可以从更全面、直观的角度来评价药物的治疗作用[8]。而气相色谱-质谱(GC-MS)是代谢组学应用于非靶向代谢组学的常规技术，具有分离效果好、灵敏度高、易于定性定量[9 - 10]。本研究采用GC-MS代谢组学方法来探索血必净注射液对百草枯中毒大鼠肺损伤的治疗效果和代谢影响。研究发现，百草枯中毒大鼠肺组织发生了明显的病理改变，百草枯中毒大鼠相比于正常大鼠，其血浆中内源性代谢物变化最显著的有7种，L-缬氨酸、琥珀酸、D -半乳糖、亚油酸、L-色氨酸5种的含量相对增加，而D -果糖、麦芽糖2种的含量则降低。血必净注射治疗后可对5种生物标志物含量进行回调，从而达到对抗百草枯毒性反应的作用。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Aglient 7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪(美国，安捷伦公司)，Aglient MSD ChemStation工作站和NIST 14质谱库；5415R高速离心机(Eppendorf Centrifuge公司)；MX-F漩涡混合器(美国，SCILOGEX公司)。

20%PQ溶液(先正达南通作物保护有限公司)；血必净注射液(天津红日药业股份有限公司)；甲醇(色谱纯，美国Sigma公司)；N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，内含1%TMCS)(美国AccuStandard公司)；O-甲基羟胺盐酸盐、脯氨酸、草酸、棕榈酸、葡萄糖、胆固醇均购自北京百灵威科技有限公司；吡啶、2-异丙基苹果酸购自美国Sigma公司。

1.2 实验动物及处置

SD雄性大鼠36只，体重200～220 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司(许可证：SCXK(湘)2016-0002)，饲养于湖南省人民医院实验动物中心动物实验室。按随机数字表法分为对照组、PQ组、血必净干预组三组，然后将每组再分为1 d、7 d亚组，每组6只。对照组灌胃1 mL生理盐水；PQ组一次性灌胃40 mg/kg[11 - 12]PQ染毒；血必净组于灌胃2 h后尾静脉注射血必净注射液8 mL/(kg·d)[13]；对照组和PQ组尾静脉注射等量生理盐水。均给药7 d，每日观察大鼠活动情况。本实验动物处置方法均符合动物伦理学标准。

1.3 样本收集

于末次给药干预后的第2 d用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉各组大鼠，收集心脏血并离心，提取上清液分装成每管200 μL至1.5 mL离心管中，于-80 ℃储存直至后续实验分析。开胸取出双侧肺组织，将右侧下叶组织浸泡于10%的中性甲醛中用于苏木精-伊红(HE)染色；其余肺组织分别装于1.5 mL EP管中速冻于液氮中，然后-80 ℃储存直至后续实验分析。

1.4 HE染色

将肺组织在10%的中性福尔马林中固定48 h，包埋在石蜡中并切成3 μm切片。使用标准方案进行HE染色后，在光学显微镜下观察肺组织病理变化。

1.5 样本处理

按照文献方法[14]进一步优化样品前处理步骤。取200 μL血浆样本于4 ℃解冻后，每份加入20 μL异丙基苹果酸-甲醇溶液(内标，1 mg/mL)，涡旋20 s，加入600 μL甲醇沉淀蛋白，涡旋20 s，在4 ℃、12 000 r/min条件下离心15 min，取上清液置于10 mL玻璃离心管中，常温下氮气吹干后，加入100 μL甲氧胺-吡啶溶液(20 mg/mL)，涡旋45 s，70 ℃水浴肟化1 h；加入100 μL硅烷化试剂N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，内含1%TMCS)，涡旋45 s，70 ℃水浴1 h，冷却至室温，取100 μL于200 μL内衬管的进样小瓶中，用于GC-MS 分析，进样量1 μL。

1.6 GC-MS分析条件

色谱条件：色谱柱为安捷伦HP-5MS熔融石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；采用程序升温的方式以70 ℃作为起始温度，保持2 min后，以8 ℃/min的速率升至140 ℃，然后以5 ℃/min的速率升至240 ℃，再以10 ℃/min的速率升至280 ℃，保持2 min；分流比：10∶1；柱流速：1 mL/min；进样口温度：280 ℃；载气为氦气。

质谱条件：EI离子源温度250 ℃；电离能量70 eV；接口温度270 ℃；扫描模式：全扫描，(m/z12～400)；扫描间隔 0.2 s；溶剂切除时间为5 min。

1.7 分析方法验证和质量控制(QC)

为了确保样本分析的精确性和可重复性，本实验采用了混合5个标准品用于样品制备过程和仪器稳定性测试。此外将所有样品等体积血浆(200 μL)制备合并的QC样品，将这些QC样品与研究样品一起分析[15 - 16]。在研究样品序列之前先连续注3针QC样品评估仪器稳定性，每6个研究样品注射1个QC样品评估重复性。

1.8 数据处理

使用Aglient MSD chemstation工作站对GC-MS总离子流图中的各种代谢物的峰面积进行积分，以相对峰面积(目标物与内标2-异丙基苹果酸峰面积之比)表示代谢物的相对含量；利用NIST数据库对血浆中的代谢物进行鉴定，得到GC-MS数据；使用化学计量学方法进行多元数据分析，得到差异代谢物。

2 结果与讨论

2.1 血必净注射液对百草枯诱导的病理变化

如图1所示，对照组的肺组织显示无明显病理变化，相反在PQ组的肺中，呈现了广泛的形态学肺损伤，例如间质水肿，肺泡出血，且随时间变化呈现肺泡壁增厚，炎性细胞浸润，甚至组织破坏。然而，用血必净处理后可减弱肺中PQ诱导的病理损伤(血必净组)。

图1 血必净对百草枯诱导的病理变化Fig.1 Pathological changes of paraquat induced by XuebijingA-1 d；B:7 d(HE×200).

2.2 代谢组学分析

2.2.1 方法学考察本研究采用混合标准品来考察仪器系统的稳定性，包括有机酸(草酸)、氨基酸(脯氨酸)、糖类(葡萄糖)、脂肪酸(棕榈酸)及胆固醇，结果见表1。从表中可看出，其中4种标准品的相对标准偏差(RSD)均小于3%，胆固醇的RSD也小于15%。说明实验过程中的误差在可接受范围之内，仪器稳定性也良好。本研究同时采用QC样本对实验稳定性和重复性进行考察，其结果显示QC样本中50个代谢物中大部分物质在肟化-硅烷化条件下表现出良好的重复性和稳定性(RSD <20%)，符合方法学的要求。

表1 各标准物质的RSD(n=5)

图2 不同组别的总离子流(TIC)色谱图Fig.2 TIC chromatograms of different groups*chromatographic peaks attribution are shrown in Table 2.

2.2.2 代谢图谱解析图2是不同组别的总离子流(TIC)色谱图，从图中可以看出不同组别之间的差异。本实验通过NIST标准质谱库和标准品对大鼠血浆中的代谢物进行定性分析，共分辨出62个色谱峰，鉴定出氨基酸、糖类、脂肪酸、有机酸等50种代谢物质，结果见表2。并通过代谢物质与内标峰面积之比进行相对定量分析，结果显示三组大鼠血浆代谢物质基本相同，但其含量存在差异。

表2 GC-MS检测到的大鼠内源性物质

图3 不同组大鼠血浆的PCA-3D图Fig.3 PCA-3D diagram of plasma in different groups of ratsA:1 d;B:7 d.

2.2.3 化学计量学分析本文采用主成分分析法(PCA)对各组大鼠的代谢信息进行分析，结果如图3所示。经治疗后第1 d，PQ组与血必净干预组并未能达到很好的分离，说明在血必净干预1 d后其治疗效果并不明显(图3A)；经治疗7 d后，PQ组与血必净组能得到较佳的分离效果，且血必净组远离模型组，向正常对照组靠近，表明在给药后7 d血必净表现出一定的抗PQ中毒效果(图3B)。为了进一步分析其差异代谢物，运用SMICA 13.0软件对第7 d的数据进行变量重要性投影分析(VIP)，得到VIP值大于1.0的20种代谢物，并将对照组与PQ组的这20种代谢物进行t-test分析，得到有统计学意义的7种代谢物，其结果见表3。

表3 差异性代谢物的统计分析结果(n=6)

Note:↑forincrease；↓fordecrease；*forp<0.05；**forp<0.01；/forp>0.05.

从表3可见，百草枯中毒大鼠相比于对照组，其血浆中内源性代谢物变化最显著的有7种，L-缬氨酸、琥珀酸、D -半乳糖、亚油酸、L-色氨酸5种的含量在百草枯中毒组增加，而D -果糖、麦芽糖2种的含量则下降，这与文献报道[17]的大致相似。L-缬氨酸、琥珀酸、L-缬氨酸是蛋白质和脂肪的代谢产物，亚油酸是人体营养中必需的脂肪酸，而D -半乳糖是一种提供能量的营养素，D -果糖、麦芽糖是糖代谢的产物，这表明百草枯中毒后蛋白质和脂肪的代谢作用增强，脂肪酸代谢增强，而能量代谢减弱。用血必净注射液治疗后，大鼠血浆中L-缬氨酸、琥珀酸、D -半乳糖、亚油酸、L-色氨酸的含量得到回调，与对照组无明显差异，说明血必净注射液通过调节体内部分氨基酸代谢、脂肪酸代谢和能量代谢对抗百草枯的毒性反应。

3 结论

在本研究中，使用基于GC-MS的代谢组学技术和化学计量学分析，在对照组与百草枯组之间鉴定出7种差异代谢物，这些生物标志物调节能量代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢和糖代谢。血必净注射液可以通过逆转代谢紊乱来减轻大鼠的肺损伤，并且初步确认了血必净调节的5种生物标志物。该研究可以促进对百草枯中毒的发病机制的进一步理解，从而促进靶向筛选治疗药物。此外，阐明血必净注射液对百草枯中毒的代谢调节作用，可为其在临床实践中的合理应用提供科学依据。