儿童医院肺炎157例痰液病原菌分布及耐药性分析

宋彬容

作者单位：绵阳市中心医院儿科，四川 绵阳 621000

儿童因自身免疫系统发育不完全，容易受外界病原菌侵袭感染。肺炎是儿科最常见的呼吸系统疾病之一，以病原菌感染为主，对儿童生命健康的威胁不容忽视[1- 2]。近年来因为临床抗菌药物的不规范使用，甚至滥用，导致病菌耐药性问题突出，再加之儿童抗菌药物使用的局限性，使得儿童肺炎的治疗十分困难。为了给临床治疗儿童肺炎合理用药提供科学依据，本研究对绵阳市中心医院ICU病房肺炎小儿痰液的病原菌分布及耐药情况进行检测分析。

1 材料与方法

1.1 标本来源选取2016年10月至2017年10月绵阳市中心医院确诊为肺炎的ICU病房小儿157例，其中男86例(54.78%)、女71例(45.22%)；年龄1月至1岁共96例(61.15%)、1～3岁共39例(24.84%)、3～7岁共18例(11.46%)、7～≤13岁共4例(2.55%)。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。小儿监护人或近亲属知情同意，签署了知情同意书。

1.2 标本采集与鉴定无菌吸痰管负压采集小儿痰液后注入无菌试管，立即送至实验室检测。将痰液接种到普通细菌培养基，35 ℃恒温培养箱(福玛电热恒温培养箱DPX-9082B-2)培养24～48 h，筛选疑似致病菌，利用ATB细菌鉴定分析仪(法国生物梅里埃)鉴定。采用卫生部质控菌株，ATCC700603(肺炎克雷伯菌)、ATCC25922(大肠埃希菌)、ATCC29213(金黄色葡萄球菌)、ATCC27853(铜绿假单胞菌)。

1.3 药敏试验药敏试验采用K-B法(药敏纸片购自杭州微生物)，无菌操作，参照药敏纸片说明书判定结果。

1.4 红霉素耐药基因检测结合细菌分离鉴定结果，选择其中具有代表性的致肺炎病原菌，进行红霉素耐药基因检测。试剂盒(天根生化)提取细菌DNA，PCR检测红霉素耐药基因mefA和ermB。引物参照文献设计，mefA和ermB基因产物长度分别为346 bp和533 bp，引物序列见表1[2-3]。

表1 mefA和ermB引物序列

2 结果

2.1 细菌检出情况从157例肺炎小儿痰液共分离160株细菌。鉴定出G-菌85株，G+菌75株，分别占总分离菌株数的53.12%和46.88%。G-菌以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主，G+菌仅分离鉴定出金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌，以金黄色葡萄球菌为主，见表2。

表2 肺炎小儿157例痰培养致病菌分布情况

2.2 病原菌耐药分析

表3 G-菌对抗生素耐药率/耐药株(%)

注：“—”表示未检测

2.2.2G+菌耐药情况 肺炎链球菌对红霉素耐药率高达87.5%，其次为复方新诺明为75%，但该菌对左氧氟沙星和万古霉素均敏感。金黄色葡萄球菌对红霉素耐药率最高，为73.1%，仅对万古霉素全部敏感，其余药物耐药率介于之间，见表4。

表4 G+菌对抗生素耐药率/耐药株(%)

注：“—”表示未检测

2.3 耐药基因分析以本次分离的致病菌占比最高的金黄色葡萄球菌和肺炎的重要致病菌之一肺炎链球菌作为对象，检测红霉素耐基因mefA和ermB。结果表明，红霉素耐药的7株肺炎链球菌，mefA和ermB的阳性率分别为71.4%和100.0%；红霉素耐药的49株金黄色葡萄球菌，mefA和ermB的阳性率分别为55.1%和73.4%，见图1，表5。

图1 红霉素耐药基因mefA和ermB电泳图，P为阳性对照，S为结果阳性，N为结果阴性

基因名称肺炎链球菌金黄色葡萄球菌所有菌株中检出率耐药菌株中检出率所有菌株中检出率耐药菌株中检出率mefA62.5(5/8)71.4(5/7)43.3(29/67)55.1(27/49)ermB87.5(7/8)100.0(7/7)55.2(37/67)73.4(36/49)

3 讨论

肺炎是儿科常见呼吸系统疾病，严重甚至可导致小儿死亡，据报道有近一半的小儿肺炎由病原菌感染导致[4]。研究结果显示，从本次ICU病房肺炎小儿痰液样本分离的G-菌占总分离菌株数的53.12%，略高于G+菌的46.88%。本次收集的痰液样本，分离到两种G+菌：金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌，分别占分离菌株总数的41.88%和5.00%。分离的G-菌以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分布最多，分别占总菌株数的28.13%和21.87%；铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌分布较少，占比分别为1.87%和1.25%。虽然本次检测发现铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌检出率不高，但此两种菌均为临床重症感染的主要病原菌[5-7]，在治疗小儿肺炎时依然须足够重视。

临床上，抗生素依然是治疗小儿肺炎的常用药物，因此致病菌耐药性考察十分有必要，对临床指导合理用药意义重大。本院ICU病房肺炎小儿痰液中检出的G-菌对β-内酰胺类抗生素中的氨苄西林和阿莫西林普遍严重耐药，对苯唑西林、头孢西丁和头孢呋辛呈现不同程度耐药：苯唑西林是铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的敏感药物，耐药率均为0.0%；头孢西丁是大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌敏感药物，耐药率均较低，分别为0.0%、0.0%、5.7%；头孢呋辛是肺炎克雷伯菌的相对敏感药物，耐药率为8.6%。有报道G-菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制可能是因为抗生素被细菌染色体或质粒介导的AmpC酶水解，从而使细菌敏感性降低[8-9]。除了β-内酰胺类抗生素，分离到的4种G-菌中，除了大肠埃希菌对喹诺酮类的左氧沙星有耐药率达20.0%，其余3种细菌对左氧氟沙星普遍较为敏感。磺胺类药物复方新诺明和氨基糖苷类的庆大霉素均是肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌的敏感药物。综合考虑，对于革兰阴性菌感染导致的肺炎，头孢西丁、庆大霉素、左氧氟沙星、复方新诺明均可作为临床推荐用药，但需结合具体病原菌种类选择最合适抗生素。需特别注意，复方新诺明毒性反应[10]，以及左氧氟沙星可能对小儿软组织造成影响，导致小儿关节病变[11]，所以在对小儿使用上需谨慎。不论使用何种抗生素，使用过程中，需要注意细菌耐药性的动态变化，因此有必要坚持定期进行病原分析及耐药性分析。

本次痰液样本共分离了两种G+菌，分别为肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌，以金黄色葡萄球菌为主。从药敏实验分析，两种G+菌对红霉素均耐药最严重，耐药率分别为87.5%和73.1%。此外，金黄色葡萄球菌对β-内酰胺的氨苄西林和阿莫西林耐药率也相对较高，分别为62.7%和50.7%。有报道，G+菌对β-内酰胺耐药机制可能是细菌自身青霉素结合蛋白(PBPs)发生了改变，降低了抗生素的亲和力[12-13]。分离的肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌对万古霉素均敏感，但由于其对小儿肝肾功能和听力系统有较大的副作用，所以小儿慎用[14-15]。综合分析，苯唑西林、庆大霉素、左氧氟沙星是临床建议选择的药物。

本文以本次分离的致病菌占比最高的金黄色葡萄球菌和肺炎的重要致病菌之一肺炎链球菌作为对象，进一步检测了其红霉素耐药基因mefA和ermB。ermB基因表示因编码的靶位改变介导耐药为主，mefA基因表示因编码的外排系统介导耐药[16]。本次分离鉴定了7株耐红霉素的肺炎链球菌，其中5株mefA阳性，占比71.4%；7株全部ermB阳性；49株金耐红霉素的黄色葡萄球菌中，27株mefA阳性，占比55.1%，36株ermB阳性，占比73.4%。结果表明从本院小儿肺炎病人痰液分离的金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌耐药基因表型中，以ermB介导编码的靶位改变最多，同时mefA介导编码的外排亦较高。

本院ICU病房肺炎小儿痰液致病菌以金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和肺炎链球菌为主。总体上，分离菌株对红霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药相对严重。苯唑西林、头孢西丁、左氧氟沙星等，均可作为临床推荐用药。对两种G+菌红霉素耐药基因检测结果显示，ermB和mefA基因普遍呈现阳性检出。综上所述，定期耐药性检测十分有必要，在临床治疗小儿肺炎时应根据致病菌种类及其耐药特征，合理用药，降低临床用药的耐药率，提高治疗效果。