大鼠产前母体冷应激对子代自发、探索及焦虑行为的影响*

李文杰，杨焕民,连 帅，徐 彬，王立鹏，臧树成，袁建彬，丁梦圆

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163000)

行为学是研究动物个体及群体为了适应内外环境刺激所作出的反应的学科。由于行为学研究的是动物的行为，因此，它也被称为“动物行为学”[1]。高架十字迷宫(the elevated plus maze，EPM)和旷场试验(open field test，OFT)是研究动物行为最广泛的实验方法，也是评价动物焦虑行为的一种常用的手段。从1950年代到70年代，旷场实验(OFT)已被用于检测啮齿动物由产前应激引起的潜在焦虑行为、自发活动和探索行为，能很好的判断动物个体在受到应激以后，其认知和行为的变化等[2,3]。EPM通过比较开放臂和闭合臂的滞留时间和运动距离来判断机体是否存在焦虑行为[4]，但OFT在行为学中通常作为对照，根据动物的趋避性结果来进行高架十字迷宫实验，它的结果与EPM一致，两者可以相互印证[5]。EPM实验在应激中也有广泛的应用，如应激对生殖、衰老、妊娠的影响等[6]，慢性不可预知应激如束缚应激中应用[7]，还有助于建立动物焦虑模型。产前冷应激也是慢性应激的一种，它不仅影响妊娠母鼠自身健康，对其子代也有一定的影响[8]。有研究发现，产前应激可改变子代记忆、影响学习能力、使子代产生焦虑或抑郁状态等[9]。在本实验室研究发现，产前冷应激可导致子代海马中糖皮质激素受体、盐皮质激素受体、羟基类固醇脱氢酶升高，海马是大脑中与认知功能有关的重要区域之一，所以本实验通过对妊娠母体进行冷应激，待产下子代后，研究产前母体冷应激对子代自发、探索行为及焦虑行为的影响，为进一步研究母体产前冷应激其子代生长发育提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及器材

SPF级Wister母鼠6只，体重210～250 g，购自齐齐哈尔医学院实验动物中心，在室温(22±2)℃、相对湿度45%环境中自由饲养，12 h昼夜交替(开灯时间为早上8:00-晚上20:00)。旷场实验器材(OFT-100)、高架十字迷宫实验器材(EPM-100)。动物实验根据黑龙江八一农垦大学实验动物伦理/管理委员会批准，并根据黑龙江八一农垦大学相关指导方针进行所有实验。

1.2 实验设计

将6只母鼠采用阴道涂片法筛选出处于发情期的母鼠，以雌雄2∶1进行合笼交配，母鼠阴道涂片发现精子即作为受孕标志，记为孕期第0日。将妊娠母鼠随机分为常温对照组(RT)和冷应激组(CT)，妊娠母鼠单笼饲养，于产前7 d将冷应激组妊娠母鼠置于4℃的饲养环境，进行冷刺激。常温对照组除饲养温度始终保持在22℃外，其他饲养条件均相同。母鼠分娩后，在常温下进行饲养，待子代断奶以后，按母鼠分组将其分为常温对照组公鼠(22只，MR)、常温对照组母鼠(15只，FR)、冷应激组公鼠(15只，MC)、冷应激组母鼠(15只，FC)四组，子代在产后四周龄时进行旷场实验、高架十字迷宫实验。

1.3 旷场实验(OFT-100)

在进行旷场实验时，子代大鼠应提前适应实验环境，然后使用TM-Vision行为科学实验系统(中国成都泰盟软件有限公司)进行OFT-100程序。OFT-100实验系统设备由不透明塑料容器(625 mm×740 mm×510 mm)和计算机控制的摄像机组成。将每只大鼠分别放置在旷场的中心，记录525 mm×525 mm×415 mm的动物试验区域内的大鼠运动活动5 min。统计处理静止时间、运动时间和距离。在下一组实验开始之前用10%乙醇彻底清洁墙壁和地板表面，以消除由先前大鼠留下的气味可能引起的偏差。评价大鼠活跃程度的指标为运动总路程和平均速度。

1.4 高架十字迷宫实验(EPM-100)

使用TM-Vision行为科学实验系统(中国成都泰盟软件有限公司)评估大鼠焦虑样行为，开始EPM-100程序。不透明塑料EPM-100实验系统装置由两个相对的开放臂(30 cm×6 cm)和两个相对的闭合臂(30 cm×6 cm×15 cm)组成，通过开放的中心平台(6 cm×6 cm)，距离地面高100 cm。高架迷宫装置通过控制底盘连接到PC软件，每只子代大鼠轻轻地放在平台的中心，运动5 min，当大鼠的四只抓在任何臂上时，该装置记录有效的进入次数。在5 min的测试期间，自动监控系统记录了闭合臂和开放臂中的进入次数、滞留时间和运动距离。在下一组实验开始之前用10%乙醇彻底清洁墙壁和地板表面，以消除由先前大鼠留下的气味可能引起的偏差。评价大鼠焦虑行为的指标为开臂进入次数、开臂滞留时间及路程。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 旷场实验

2.1.1 总体活动 由表1可知，常温对照组公鼠与冷应激组公鼠的总路程、平均速度、静止时间、运动时间之间无显著差异(P>0.05)，常温对照组母鼠与冷应激组母鼠的总路程、平均速度、静止时间、运动时间之间无显著差异(P>0.05)。

2.1.2 周边区活动 由表2可知，常温对照组公鼠与冷应激组公鼠的四边活动时间和四角活动时间之间无显著差异(P>0.05)，常温对照组母鼠与冷应激组母鼠的四边活动和四角活动时间之间无显著差异(P>0.05)。

2.1.3 中央区活动 由表3可知，常温对照组公鼠与冷应激组公鼠中央区活动时间和周边活动之间无显著差异(P>0.05)，常温对照组母鼠和冷应激组母鼠中央区活动时间和周边活动之间无显著差异(P>0.05)。

Tab. 1 Open field test of rats in different

MR:Normal temperature control group of male rats;FR:Normal temperature control group female;MC:Cold stress group of male rats;FC:Cold stress group of female rats

Tab. 2 The activities of the peripheral areas of the rats in each group in the open field test(s,

MR:Normal temperature control group of male rats;FR:Normal temperature control group female;MC:Cold stress group of male rats;FC:Cold stress group of female rats

Tab. 3 Activity of peripheral regions in each group of rats in open field test(s,

MR:Normal temperature control group of male rats;FR:Normal temperature control group female;MC:Cold stress group of male rats;FC:Cold stress group of female rats

2.2 高架十字迷宫

2.2.1 总体活动 由图1可知，冷应激组公鼠进臂总次数高于常温对照组公鼠进臂总次数(P<0.05)，常温对照组母鼠和冷应激组母鼠进臂总次数无显著差异(P>0.05)。

Fig.1The elevated plus maze of total number of arm entries
*P<0.05vscontrol

2.2.2 中央平台活动 冷应激组公鼠中央平台区路程显著高于常温对照组公鼠中央平台区路程(P<0.01，图2 A)，但常温对照组母鼠和冷应激组母鼠中央平台区路程之间无显著差异(P>0.05，图2 A)。冷应激组公鼠中央平台区滞留时间显著高于常温对照组公鼠(P<0.01，图2 B)，常温对照组母鼠与冷应激组母鼠中央平台区滞留时间之间无明显差异(P>0.05，图2 B)。

Fig.2The elevated plus maze of central platform activity
A：Path of central platform；B:Central platform time
**P<0.01vscontrol

2.2.3 开臂活动 冷应激组公鼠开臂进入次数显著高于常温对照组公鼠进入次数(P<0.01，图3 A)，但常温对照组母鼠和冷应激组母鼠开臂进入次数之间无显著差异(P>0.05，图3 A)。常温对照组与冷应激组公鼠、母鼠的开臂进入次数百分比之间无显著差异(P>0.05，图3 B)。冷应激组公鼠、母鼠开臂滞留时间显著高于常温对照组公鼠、母鼠开臂滞留时间(P<0.01,图3 C)。冷应激组公鼠开臂滞留时间百分比显著高于常温对照组公鼠(P<0.01，图3 D)，冷应激组母鼠开臂滞留时间百分比高于常温对照组母鼠(P<0.05,图3 D)。

Fig.3The elevated plus maze of open arm activity
A:Number of open arm entries;B:Open arm otal arm entries;C:Open arm time;D:Open otal time
*P<0.05，**P<0.01vscontrol

2.2.4 闭臂活动 常温对照组公鼠、母鼠与冷应激组公鼠、母鼠闭臂进入次数之间无显著差异(P>0.05，图4 A)。常温对照组公鼠、母鼠与冷应激组公鼠、母鼠闭臂进入次数百分比之间无显著差异(P>0.05,图4 B)。常温对照组公鼠、母鼠闭臂滞留时间显著高于冷应激组公鼠、母鼠两组(P<0.01,图4 C)。常温对照组公鼠、母鼠的闭臂滞留时间百分比显著高于冷应激组公鼠、母鼠(P<0.01，图4 D)。

Fig.4The elevated plus maze of closed arm activity
A：Number of closed arm entries;B:Closed arm/total arm entries;C:Closed arm time;D:Closed/total times
**P<0.01vscontrol

2.2.5 开臂和闭臂运动路程 冷应激公鼠开臂区运动路程显著高于常温对照组公鼠开臂区运动路程(P<0.01，图5 A)，冷应激组母鼠开臂区运动路程高于常温对照组母鼠开臂区运动路程(P<0.05，图5 A)。冷应激组公鼠、母鼠开臂区运动路程百分比高于常温对照组公鼠、母鼠开臂区运动路程百分比(P<0.05，图5 B)。常温对照组与冷应激组公鼠、母鼠闭臂区运动路程之间无明显差异(P>0.05，图5 C)。冷应激组公鼠、母鼠闭臂区运动路程百分比低于常温对照组运动路程百分比(P<0.05，图5 D)。

Fig.5The elevated plus maze of open arm and closed arm movement
A:Open arm area distance;B:Open arm/total distance;C:Closed arm area distance;D:Closed arm otal time
*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3 讨论

本实验研究大鼠产前妊娠母体冷应激对子代自发、探索及焦虑行为的影响。首先在大鼠母体冷应激中，两组除应激温度不同以外其他饲养条件都相同；待其分娩以后，子代的饲养条件一致，减小因为环境、温度不同带来的误差。其次，在旷场实验和高架十字迷宫实验中，每次实验开始前，都确保实验仪器干净，没有气味残留。操作手法都为同一个人，减少了人为造成的误差。在旷场实验中，总路程和速度是评价大鼠自发活动的主要数据[10]，常温对照组与冷应激组公鼠、母鼠的总路程和速度之间无明显差异，表明产前冷应激对子代自发活动无影响。大鼠的趋避性是根据在周边区活动总时间来判断的，常温对照与冷应激组公鼠、母鼠的周边总时间(四角和四边总时间)之间无明显差异，表明了产前冷应激对子代的探索行为无影响。Tooru Tazumi等在研究中发现冷应激大鼠子代在开场实验中的自发行为及探索行为之间无显著差异，这与本实验结果一致[11]。开场实验的趋避性结果可以提示进行深入焦虑、抑郁相关的实验，但是在本实验中，旷场实验趋避性结果与高架十字迷宫不一致，可能是因为冷应激作用于母体，对子代潜在的影响需要进一步实验印证，也有可能是母体产前冷应激使后代海马区受到损害而导致子代行为发生异常[12]。

在高架十字迷宫实验中，进臂总次数和进入闭臂次数可以整体评价大鼠的活跃程度。常温对照组与冷应激组公鼠进臂总次数之间差异显著(P<0.05)，而母鼠的进臂总次数无明显差异，常温对照组与冷应激组公鼠、母鼠进入闭臂总次数和进入闭臂次数百分比之间无明显差异，整体上说明了产前冷应激对子代活跃程度无明显影响，而在Estanislau等人的研究中，产前应激可以影响子代的行为，母体应激后的子代在闭臂区停留时间延长，说明产前应激影响子代的活跃程度，而在本实验中并没有此现象，可能因为应激的方式及强度不同所引起的[13]。在开臂的滞留时间和路程可以评价大鼠的焦虑行为[14]，焦虑行为与开臂滞留时间成反比，开臂滞留时间停留越短，表示越焦虑。常温对照组公鼠与冷应激组公鼠、母鼠开臂滞留时间和开臂滞留时间百分比之间差异非常显著(P<0.01)，但是冷应激组公鼠与母鼠比正常组公鼠和母鼠的开臂滞留时间长，没有呈现焦虑行为，说明母体产前冷应激使子代的焦虑行为减少。产前母体冷应激后的子代面对高空并不能表现出恐惧、紧张，反而停留时间延长，而在Van den Hove D L A等在实验研究中发现产前应激使子代在高架十字迷宫中产生更多的焦虑行为，即在开臂停留时间较短[15]，与本实验结果不符。

在我国东北地区，寒冷无法避免，而妊娠期间冷应激更是造成妊娠母体发生一系列反应，使妊娠母体及子代造成不可逆的反应。在本实验中产前冷应激子代在进行行为学测试时，出现以上这样的结果可能是因为产前母体冷应激使子代的海马发生炎症反应，产生了焦虑行为减少的异常行为[16]，例如在王凌星等人的研究中发现，产前手机应激通过改变子代大鼠海马 BDNF 而影响齿状回的 PCNA 和 DCX 表达[17]；还可能是产前母体冷应激会影响子代的大脑边缘区，胎儿在母体宫内因环境改变而导致胎儿大脑合成受到影响[18-19]，影响子代的神经发育，如王凌星等人发现产前应激可能改变子代大鼠脑缺血/再灌注后星形胶质细胞上EphA4受体的表达，促进星形胶质细胞活化，产生神经蛋白聚糖[20]；也可能是母体冷应激以后，影响幼鼠的海马CA2区发育[21]，导致子代产生焦虑样行为减少的异常行为。还有可能是母体在妊娠期间进行冷应激时发生了炎症反应，影响了子代生长发育，从而导致子代行为发生异常[22]。这些猜测为以后研究产前冷应激提供了新的思路。

综上所述，产前冷应激对子代的自发活动、探索行为及活跃程度无显著影响，但是使子代产生了焦虑行为减少的异常行为。