新生儿携带IMP-4肺炎克雷伯菌的分子分型特征▲

梁军荣 潘新年 黄维真 梁志坤 张 清 闫 芳 潘慧敏

(广西壮族自治区妇幼保健院外科，南宁市 530021，电子邮箱：1742644494@qq.com)

肺炎克雷伯菌是新生儿感染最常见的病原菌之一，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的出现给新生儿感染的治疗、院内感染的控制带来很大的困难。研究耐药菌的分子分型对临床诊断、控制医院感染的暴发流行具有重要意义。多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)技术是直接检测多个管家基因的核苷酸序列从而发现细菌变异的分型方法，多用于种群结构和进化关系的研究。因此，本研究采用MLST技术对携带IMP-4基因的肺炎克雷伯菌进行序列分型研究，并采用eBURST软件进行亲缘分析，旨在为医院感染控制提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 收集2013年6月至2017年6月在广西壮族自治区妇幼保健院(新阳和厢竹院区)、南宁市妇幼保健院住院的新生儿血、痰、肺泡灌洗液、分泌物等样本，分离获得的49株耐亚胺培南、美罗培南或厄他培南肺炎克雷伯菌。其中，应用法国生物梅里埃公司VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪进行细菌鉴定及药敏试验[最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)法]，根据美国临床和实验室标准协会(2016)的标准，厄他培南MIC≥2 μg/mL，或者美罗培南、亚胺培南MIC≥4 μg/mL的肺炎克雷伯菌为耐药菌株，所需标准菌株(大肠埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603)均由广西临床检验中心提供。剔除同一患儿相同部位的重复菌株。

1.2 携带IMP-4肺炎克雷伯菌的筛选及鉴定 提取49株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌DNA(煮沸法)、PCR扩增碳青霉烯酶基因、序列测定(由Inviotrigen公司完成)，经与GenBank序列比对，其中10株检出IMP基因，均为blaIMP4型；与NCBI Blast数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的数据进行对比，发现其与IMP-4亚型同源性达99%。

1.3 主要试剂及仪器 PCR DNA聚合酶购于天根生物公司(批号：S7116)，胰蛋白胨(批号：2324507)和酵母提取物(批号：2340951-02)购自Oxid公司。Gel DocTMXR电泳凝胶图像分析系统(美国的Bio-Rad公司)，TOne 96G梯度PCR仪(美国Biometra公司)。

1.4 引物合成 参照MLST网站(http://spneumoniae.mlst.net/)提供的引物序列,由Inviotrigen公司合成gapA、infB、 mdh、pgi、phoE、rpoE、tonB 7个管家基因引物。

1.5 管家基因的PCR检测 25 μL反应体系：PCR DNA聚合酶12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，细菌总DNA 3 μL，双蒸水8.5 μL。反应步骤：95℃ 5 min；95℃ 40 s；50℃ 40 s；72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 10 min。反应结束后4℃电泳鉴定。

1.6 电泳及PCR产物回收 取PCR产物加样于溴化乙锭凝胶上，120 V电泳30 min，在凝胶成像系统下观察并拍照，然后切胶送Inviotrigen公司测序。

1.7 序列比对和MLST数据分析 将序列提交到数据库(http://bigsdb.web.pasteur.fr/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef_public)进行在线序列比对，获得管家基因等位基因编码，与gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB成为管家基因谱组合，每个编码组合对应 1 个序列型，与MLST数据库中已有管家基因谱进行比对，得到每株细菌序列型。

1.8 PCR检测β-内酰胺酶耐药基因 参考GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)基因序列信息并合成β-内酰胺酶耐药基因扩增引物，引物由Inviotrigen公司合成。PCR的反应体系和反应步骤参照管家基因的PCR 扩增、测序。

1.9 eBURST分析 采用eBURST软件version 3(http://eburst.mlst.net/)对本研究获得的等位基因序列进行亲缘分析。7个位点中有≥6个相同归类为1个分型组,1个分型组中包含≥3个序列型的定义为1个克隆复合体(clonal complex,CC)。每个CC中有1个经计算推测出的起源序列型,被认为是祖先序列型,复合体中的其他序列型通过直线与起源序列型相连,直线长度表示亲缘关系远近。

2 结 果

2.1 MLST结果 经与MLST数据库进行比对，10株携带IMP-4的肺炎克雷伯菌可分成6个序列型，其中以序列型20为主(4株)，占40%,分布在两家医院，其次为序列型1473，占20%。所有菌株均检测到耐药基因SHV-11及TEM-1。见表1。

表1 10株携带IMP-4的肺炎克雷伯菌的序列型及耐药基因

注：A为广西区妇幼保健院(厢竹院区)，B为广西区妇幼保健院(新阳院区)，C为南宁市妇幼保健院。

2.2 eBURST分析结果 10株菌株有1个主要CC(CC11)，包含序列型20、序列型37、序列型234，涉及6株菌株(占60%)，属于祖先型为序列型11的复合体，其他均可认为是单独的序列型，而不属于任何一个CC，见表2。

表2 10株携带IMP-4的肺炎克雷伯菌的eBURST分析结果

注：FREQ为菌株出现频率，SLV 为单位点突变， DLV为双位点突变，TLV为三位点突变，SAT为卫星型。

3 讨 论

近年来，在新生儿中出现耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌，但有关新生儿耐药基因的研究报道较少。本研究在新生儿中收集到的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌主要是产B类碳青霉烯酶，IMP-4是其主要基因型[1-2]。其编码基因同时携带β-内酰胺酶耐药基因SHV-11、TEM-1，由于常与其他耐药基因共存，可引起对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、单酰胺类等抗生素的多重耐药。

MLST分析结果显示，10株携带IMP-4的肺炎克雷伯菌分为6个不同序列型，其中以序列型20为主，其次是序列型1473；同一基因型可存在于不同的医院，同一医院存在不同基因型，即序列型别分布散在，型别未呈现集中的趋势，提示上述菌株的遗传背景具有多样性。

目前，国内外有关携带IMP-4的肺炎克雷伯菌的MLST分析研究极少，所报告的序列型别也有所不同，在澳大利亚其型别为序列型1727、序列型1728、序列型1729[3]，在中国香港为序列型1306、序列型889[4]，在中国大陆有序列型105、序列型1876、序列型147[5-6],未见有关主要型别及流行型别的研究报道。目前，国内未见携带IMP-4型的序列型20肺炎克雷伯菌的研究报道，但有报道显示，在山东省一家新生儿病房序列型20见于NDM-1型的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌[7]，而在希腊其见于携带SHV-5型的肺炎克雷伯菌[8]，两者的共同特点是序列型20肺炎克雷伯菌可引起新生儿感染的暴发。本研究纳入两家医院的新生儿中， 序列型20是携带IMP-4的肺炎克雷伯菌最主要的克隆株，据此推测序列型20易捕获携带B类碳青霉烯酶基因的耐药质粒,引起新生儿感染。同时，eBURST分析结果显示，序列型20、序列型37、序列型234同属一个主要CC，序列型11为其祖先型。序列型11是我国携带kpc-2的肺炎克雷伯菌的主要克隆型[9]，序列型20与序列型11有较近的亲缘关系，Institut Pasteur MLST 数据库(http://bigsdb.web.pasteur.fr/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef_public)显示序列型11与序列型20之间只存在3个管家基因(rpoB、phoE、infB)的差异。

此外，本研究中，4株序列型20分别来自两家医院，分离时间集中在2013年，其中1株分离时间是2013年12月，其余3株来自同一家医院，分离时间在2013年7月，表明携带IMP-4的肺炎克雷伯菌在本地区同一家医院具有较高聚集性，可能存在序列型20肺炎克雷伯菌院内感染的发生；且4株序列型20均携带IMP-4、SHV-11、TEM-1基因，具有相同的基因特征。这提示携带IMP-4 的序列型20肺炎克雷伯菌感染在本地区同一家医院曾出现暴发。

总之，序列型20是这两家医院新生儿产IMP-4肺炎克雷伯菌的主要流行克隆群，且序列型20在其中一家医院中曾发生医院感染暴发，应引起医院相关部门和医务人员的高度重视。