转化生长因子β1在烟曲霉暴露致支气管哮喘大鼠气道重塑中的作用

邓林 徐浩 战欣 刘晓玲 高福生潍坊医学院6053;潍坊医学院附属医院呼吸内科6000

烟曲霉菌是一种常见的霉菌,是重症支气管哮喘(哮喘)独立的危险因素[1]。研究表明,在哮喘患者中,28.5%的患者烟曲霉抗原皮肤试验呈阳性,且与哮喘严重程度呈明显相关。英国学者Dening首先提出了真菌致敏的严重哮喘的概念,之后的学者们也尝试着总结了其特征性表现。先前我们的试验也证实,烟曲霉暴露确实可以加重哮喘大鼠气道上皮下纤维化[2],但是具体机制仍不明确。

本研究通过对鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏液致敏和OVA 激发液激发建立的哮喘大鼠模型,吸入烟曲霉菌分生孢子,从而研究转化生长因子 β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)与气道重塑之间的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料 烟曲霉菌株(潍坊医学院附属医院细菌室),OVA 干粉(solarbio,中国北京索来宝科技有限公司),氢氧化铝(中国天津博迪化工股份有限公司),SB-431542(中国上海前尘生物科技有限公司),Anti-TGF-β1抗体(美国abcam),Tris-EDTA 抗原修复液、抗鼠/兔通用型免疫组织化学检测试剂盒(美国proteintech),TGF-β1酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(中国上海伊莱瑞特生物科技有限公司),Masson三色染色试剂盒(中国北京索莱宝有限公司),雾化器(boy037G 600型,pari德国),雾化箱(自制,密闭有机玻璃50 cm×27 cm×25 cm)。

1.2 制备烟曲霉菌孢子悬液、致敏液、雾化液取自于侵袭性肺曲霉菌病患者的一株烟曲霉。将烟曲霉在37 ℃的沙氏琼脂平板培养基上培育2 周。参考文献[2]的方法,制得分生孢子悬液,离心浓缩后,用血球计数板调整分生孢子浓度,每1 ml生理盐水中含有1×105的分生孢子。致敏液：1 mg OVA+100 mg氢氧化铝+1 ml生理盐水混悬液,现用现配。雾化液：OVA 50 mg溶于注射用水5 ml,现用现配。

1.3 实验动物及分组 选取健康清洁型的雄性wistar大鼠共32只,由济南朋悦实验动物有限公司提供[SCXK(鲁)20140007],4～5 周龄,体质量140～170 g。本研究符合 《赫尔辛基宣言》的原则。在潍坊医学院动物房饲养,室温26 ℃,湿度50%,模拟昼夜灯光分别为12 h,标准饲料,自由饮水。随机分为4组,每组8只。Ⅰ组(哮喘组)：用致敏液致敏、雾化液激发的方式建立哮喘大鼠模型,致敏,在第1天、第8天,在大鼠两腹股沟、腹和前肢皮下注射致敏液,每点0.2 ml,腹腔注射0.2 ml；雾化,在第15、18、21天,将大鼠放置于自制密闭有机玻璃箱(50 cm×27 cm×25 cm)内,连接雾化器,用雾化液进行雾化吸入激发,每周3次,每次30 min。Ⅱ组(哮喘+烟曲霉孢子吸入组)：用致敏液致敏、雾化液激发的方式建立哮喘大鼠模型,在第23、26、30、33、37、40 天,经鼻滴入烟曲霉菌分生孢子悬液100μl,用10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠,经鼻滴入100μl烟曲霉孢子悬液,每侧鼻孔滴入50μl,维持垂直体位10 min。Ⅲ组(哮喘+生理盐水吸入组)：用致敏液致敏、雾化液激发的方式建立哮喘大鼠模型,在第23、26、30、33、37、40天,经鼻滴入0.9%生理盐水100μl。Ⅳ组(哮喘+烟曲霉孢子吸入+TGF-β1 抑制剂滴鼻组)：用致敏液致敏、雾化液激发的方式建立哮喘大鼠模型,在第23、26、30、33、37、40天,经鼻吸入烟曲霉菌分生孢子悬液100μl,在每次分生孢子悬液吸入1 h 之前经鼻给予14 mg/L 的SB-431542 0.5 ml。SB-433542的剂量参考文献[3],后在本实验正式开始之前经预实验证实所得。

1.4 手术与取材 各组大鼠于最后一次经鼻吸入烟曲霉孢子后24 h处死。取右肺上叶液氮中保存待用,将右肺下叶置于10%甲醛中固定72 h,常规脱水、石蜡包埋,5μm 厚切片,进行 HE 及Masson三色(Masson trichrome)染色。经气管插管行左肺支气管肺泡灌洗,回收的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)经离心后,上清液-80 ℃保存。

1.5 ELISA ELISA 法测定BALF 上清液中TGF-β1 含量,取出 BALF 上清液,室温孵育20 min,根据ELISA 试剂盒操作说明书步骤进行操作。用酶标仪在450 nm 波长测定各孔光密度(A)值。

1.6 肺组织中TGF-β1免疫组织化学染色 取已经包埋好的大鼠肺组织石蜡块切片,脱蜡入水,制作组织切片。选取兔抗鼠TGF-β1单克隆抗体,工作浓度为1∶500,选取抗鼠/兔通用型二抗,DAB染色,HE复染,用中性树脂封存切片。阳性结果为支气管周围细胞外基质,特别在气道网状基底膜区域、固有层以及黏膜下层出现黄色或棕黄色的颗粒。每只大鼠随机选取5个直径在500～1 000μm的细支气管区,应用Image Pro-Plus software 6.0软件计算阳性结果信号累积光密度。以TGF-β1染色阳性的IOD 表示TGF-β1表达水平。

1.7 肺组织HE染色、Masson染色 按照HE染色试剂盒说明进行染色。阳性结果为胞浆呈淡红色,胞核呈蓝黑色。在HE染色切片上,Olympus显微镜下放大200 倍,CCD 数字相机采集图像,各只大鼠均于直径500～1 000μm 的细支气管区中取像,随机选取5个视野,测量支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度。

按照Masson染色试剂盒说明进行染色。阳性结果为胶原纤维呈蓝色,细胞核呈黑蓝色。在Masson染色切片上,与上述方法一致,测量气道上皮基底膜下20μm 区域内被染成蓝色的非细胞部分的面积和该区域的总面积,以被染成蓝色部分的面积占该区域总面积的百分比表示上皮下胶原纤维沉积的程度。

1.8 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,定量资料以表示。2组间比较采用两独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间均数检测采用SNK 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BALF 上清液中 TGF-β1含量 Ⅱ 组 BALF中TGF-β1的含量[(85.06±14.30)μg/L]与Ⅲ组BALF中TGF-β1的含量[(38.90±8.31)μg/L]相比,TGF-β1水平明显升高(t=7.89,P＜0.01)。Ⅰ组BALF中TGF-β1 的含量[(33.21±5.14)μg/L]与Ⅲ组相比,TGF-β1水平差异无统计学意义(t=-1.64,P＞0.05)。Ⅳ组BALF中TGF-β1的含量[(65.85±11.32)μg/L]与Ⅱ组相 比,TGF-β1水平降低(t=2.98,P＜0.05)。

2.2 肺组织中TGF-β1免疫组织化学染色 Ⅱ组肺组织中TGF-β1 的表达(IOD 为2.13±0.15)与Ⅲ组肺组织中TGF-β1的表达相比(IOD 为0.90±0.07),TGF-β1表达明显升高(t=21.06,P＜0.05)。Ⅳ组肺组织中 TGF-β1的表达(IOD 为1.68±0.15)较Ⅱ组TGF-β1表达明显降低(t=5.90,P＜0.05)。Ⅰ组肺组织中 TGF-β1 的表达(IOD 为0.82±0.01)与Ⅲ组相比,TGF-β1表达差异无统计学意义(t=-3.40,P＞0.05)(图1、2)。

图1 各组大鼠肺组织TGF-β1 表达病理学观察 HE ×200 A：哮喘组；B：哮喘+烟曲霉孢子吸入组；C：哮喘+生理盐水吸入组；D：哮喘+烟曲霉孢子吸入+TGF-β1 抑制剂滴鼻组

2.3 肺组织中HE 染色、Masson 染色 肺组织HE染色观察大鼠气道壁及平滑肌增厚情况。肺组织Masson染色观察大鼠气道上皮下胶原纤维沉积情况。Ⅱ组HE 染色为红色的支气管壁厚度[(17.39±2.89)μm2/μm]、支气管平滑肌厚度[(12.21±2.50)μm2/μm]与Ⅲ组支气管壁厚度[(8.67±1.48)μm2/μm]、支气管平滑肌厚度[(5.06±1.78)μm2/μm]相比,明显增厚(t=7.60、6.58,P值均＜0.05)。染色为蓝色的胶原纤维Ⅱ组上皮下胶原沉积[Masson trichrome蓝染面积/基底膜下 20 μm 区域面积为(42.52±7.34)%]与Ⅲ组上皮下胶原沉积[Masson trichrome蓝染面积/基底膜下20μm 区域面积为(16.92±3.11)%]相比,明显沉积(t=9.14,P＜0.05)。

图2 各组大鼠肺组织TGF-β1 表达形态学分析

图3 各组大鼠气道壁、平滑肌增厚病理学观察 HE ×200 A：哮喘组；B：哮喘+烟曲霉孢子吸入组；C：哮喘+生理盐水吸入组；D：哮喘+烟曲霉孢子吸入+TGF-β1 抑制剂滴鼻组

Ⅳ组支气管壁厚度[(9.92±1.32)μm2/μm]、支气管平滑肌厚度[(5.21±3.01)μm2/μm]与Ⅱ组相比,未见明显增厚(t=6.64、5.06,P值均＜0.05)。Ⅳ组上皮下胶原沉积[Masson trichrome蓝染面积/基底膜下20μm 区域面积为(19.03±6.88)%]与Ⅱ组相比,胶原纤维未见明显沉积(t=6.58,P＜0.05)。Ⅰ组大鼠支气管壁厚度[(7.61±1.18)μm2/μm]、支气管平滑肌厚度[(4.16±1.59)μm2/μm]与Ⅲ组相比,气道壁增厚差异无统计学意义(t=-1.59、-1.07,P＞0.05),Ⅰ组上皮下胶原沉积[Masson trichrome蓝染面积/基底膜下20μm区域面积为(14.15±3.08)%]与Ⅲ组相比,胶原纤维沉积差异无统计学意义(t=-1.42,P＞0.05)(图3～7)。

图4 各组大鼠气道壁增厚形态学分析

3 讨论

烟曲霉菌,在室内环境和粮食粉尘中广泛存在。由于其体积小(直径为2～3μm)和疏水性,可能会悬浮在空气中很长一段时间,因此增加了吸入人肺泡组织中的可能性,但是却只有在部分易感人群中才会导致一系列疾病[4-5]。研究证实,烟曲霉菌孢子长期吸入与哮喘患者呼吸道症状密切相关[6],但是最常见的表现形式是哮喘患者对烟曲霉菌的超敏反应,它是ABPA 发展的第一步,当然只有少部分烟曲霉菌超敏反应的患者发展为ABPA[1]。

图5 各组大鼠气道平滑肌增厚形态学分析

图6 各组大鼠气道上皮下胶原纤维沉积病理学观察 HE ×200 A：哮喘组；B：哮喘+烟曲霉孢子吸入组；C：哮喘+生理盐水吸入组；D：哮喘+烟曲霉孢子吸入+TGF-β1 抑制剂滴鼻组

图7 各组大鼠气道上皮下胶原纤维沉积形态学分析

我们前期的研究[2,7]发现烟曲霉暴露可以加重哮喘大鼠的Th2型气道炎症,促进气道上皮下纤维化,从而增加气道反应性。并且烟曲霉暴露对哮喘大鼠的影响不依赖于烟曲霉在气道的定植。

烟曲霉菌暴露加重哮喘气道重塑的机制目前尚未阐明。本研究发现,哮喘大鼠给予慢性烟曲霉菌暴露后,无论在BALF中TGF-β1的含量还是肺组织免疫组织化学中TGF-β1的表达均明显增加,同时,HE染色提示支气管管壁增厚,支气管平滑肌增厚,Masson染色显示支气管上皮组织下胶原沉积进一步加重(t=7.60、6.58、9.14、7.89、21.06,P值均＜0.05)。而在哮喘大鼠慢性烟曲霉暴露后给予 TGF-β1 抑制剂处理,TGF-β1 表达明显减低,同时支气管管壁增厚程度、支气管平滑肌增厚程度及支气管上皮组织下胶原沉积的程度均明显减轻(t=6.64、5.06、6.58、2.98、5.90,P值均＜0.05)。结果提示吸入慢性烟曲霉暴露,可能通过增加TGF-β1表达的方式,促进气道管壁增厚、支气管平滑肌增厚、上皮组织下胶原沉积,表现为肺组织纤维化程度增加,从而加重气道重塑。

相关研究也进一步证实了这点。多项研究证实[8-10],TGF-β1/Smad信号通路与纤维化程序的启动相关,而Stumm 等[11]证实了其在哮喘气道重塑形成的过程中同样发挥重要的作用。在对慢性哮喘发病机制的研究中,朴红梅和宋秋红[3]得出了如下结论：TGF-β 受体抑制剂可能通过竞争抑制TGF-β 与受体的结合,进而抑制其下游因子CTGF m RNA 和胶原α1m RNA 的表达,延缓或改善气道重塑。同时约1/3到1/2的重度哮喘患者存在对曲霉菌的过敏[12]。哮喘时气道微环境的改变有利于烟曲霉孢子在呼吸道黏膜的黏附滞留,而烟曲霉菌在肺内的长时间停留,是气道炎症和气道纤维化的原因[13]。而且越来越多的证据表明真菌过敏与重症哮喘表型有关,即真菌致敏的重症哮喘。如果不及时治疗,气道纤维化会导致肺功能的逐渐丧失[12],而且现在基于真菌致敏的重症哮喘的抗真菌治疗的相关研究也很少[14]。

总之,本研究利用OVA 致敏激发液激发建立的哮喘大鼠模型,然后给予慢性烟曲霉暴露,并同时给予 TGF-β1 抑制剂处理,结果显示TGF-β1 抑制剂可以抑制烟曲霉菌暴露所致的气道重塑。本研究结果提示TGF-β1可能参与了慢性烟曲霉暴露所致哮喘的气道重塑,其确切的机制有待进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突