规模化猪场猪源沙门氏菌的耐药性及相关耐药基因检测

张 海，方 英，徐春志，景书灏，杨 峰，陈 红，袁翠霞

（贵阳市动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550081）

沙门氏菌（Salmonella）是肠杆菌科沙门氏菌属的成员，是危害人类和畜禽健康的重要病原体之一，在医学、兽医和公共卫生学上都有非常重要的意义。由于抗菌药物长期、广泛和不合理使用，使沙门氏菌的耐药菌株和多重耐药菌株不断出现，耐药性问题日益突出，同时也威胁到了人类的健康。为此笔者于2017年11月至2018年11月在贵阳富之源农业科技有限公司对临床上分离到的6株猪源沙门氏菌进行抗菌药物的药敏试验和相关耐药基因检测，并对抗菌药物的耐药性与相应耐药基因关系进行分析，为临床治疗猪沙门氏菌病时合理用药及沙门氏菌多重耐药机制的进一步研究提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 菌株

6株猪源沙门氏菌分离自贵州省某规模化养猪场送检的病、死猪样本，由贵阳市动物疫病预防控制中心分离、纯化、鉴定、保存。

1.2 主要试剂和培养基

2×TaqPCR MasterMix、DL 2 000 DNA Marker、细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，MH琼脂（Mueller-Hinton Agar）和MH肉汤购置青岛海博生物技术有限公司。

1.3 药敏纸片与药敏试验

试验所用的抗菌药物包括β-内酰胺类的头孢克洛、青霉素、氨苄西林、阿莫西林、头孢拉定，氨基糖苷类的卡那霉素、新霉素、丁胺卡那、链霉素、庆大霉素，氟喹诺酮类的氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、吡哌酸，共15种兽医临床常用药敏纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司。药敏纸片琼脂扩散法参照美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）制定的标准进行，药敏结果判断标准按NCCLS2010年标准，作出结果判断。

1.4 引物设计与合成

参照GenBank上已发布的9种畜禽病原菌的相关耐药基因序列，运用引物在线设计软件设计特异性引物，由上海生工生物工程有限公司合成，分别用于扩增β-内酰胺类耐药基因CTX、SHV、TEM，氟喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrS、qnrB，氨基糖苷类耐药基因aacC4、addA1、aacC2。耐药基因PCR扩增的引物序列详见表1。

表1 耐药基因PCR扩增引物序列

1.5 细菌基因组DNA的提取

按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取试验菌株基因组DNA。

1.6 耐药基因的PCR扩增

以提取的沙门氏菌基因组DNA为模板，建立20 μL PCR 反应体系：2×TaqPCR MasterMix 10.0 μL，DNA 模板 1.0 μL，上游引物（10 μmol/L）1.0 μL，下游引物（10 μmol/L）1.0 μL，灭菌双蒸水 7.0 μL。反应结束后，取PCR产物6.0 μL在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳。

2 结果与分析

2.1 沙门氏菌分离株药敏试验结果

对分离出来的6株猪源沙门氏菌参照美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）制定的标准进行药物敏感性试验，试验结果具体见表2。由表2结果显示，分离出来的6株猪源沙门氏菌对青霉素、氨苄西林和吡哌酸高度耐药，耐药率为100.00%（6/6）；对其余抗菌药物的耐药率分别为：阿莫西林、环丙沙星耐药率为83.33%（5/6），卡那霉素、诺氟沙星耐药率为66.67%（4/6），头孢拉定、新霉素、丁胺卡那和恩诺沙星的耐药率为50.00%（3/6），氧氟沙星的耐药率为33.33%（2/6），头孢克洛、链霉素和庆大霉素的耐药率为16.67%（1/6）。

表2 6株沙门氏菌分离株对15种抗菌药物敏感性试验

2.2 耐药基因扩增结果

图1为PCR和琼脂糖凝胶电泳分析结果。由图1可知，该规模化猪场6株猪源沙门菌分别扩增出β-内酰胺类耐药基因TEM、CTX和SHV的菌株比例分别为 50.00%（3/6）、50.00%（3/6）和33.33%（2/6）；扩增出氨基糖苷类耐药基因addA1、aacC2和aacC4的菌株比例分别为50.00%（3/6）、50.00%（3/6）和 50.00%（3/6）；扩增出氟喹诺酮类耐药基因qnrB和qnrS的菌株比例分别为50.00%（3/6）和 33.33%（2/6），未能检测到耐药基因qnrA。

图1 耐药基因PCR扩增结果

3 讨论

近年来，随着生活水平的不断提高，人们对畜禽类产品的需求也快速增长，同时大量的抗菌药物被使用。抗生素的广泛使用及滥用导致沙门氏菌及其它细菌对抗菌药物的耐药情况也日益严重[1]，世界各地报道多重耐药沙门氏菌的分离率也越来越高[2]。

本研究结果显示，沙门氏菌分离株对青霉素、氨苄西林、吡哌酸、阿莫西林、环丙沙星、卡那霉素和诺氟沙星等抗生素的耐药率较高，这与江萍等[3]研究人员报道的结果基本一致，提示临床上应谨慎用药。头孢拉定、新霉素、丁胺卡那、恩诺沙星和氧氟沙星，在临床上可选择性使用。头孢克洛、链霉素和庆大霉素的耐药率为在20%以下，在临床上可以继续使用。在多重耐药方面，对7种以上抗生素耐药的菌株达到66.67%，这与潘志明等[4]的报道一致。在临床上应该合理用药，采用多种药物交替使用等用药方式以降低细菌产生耐药性的几率。

对分离到的猪源沙门氏菌进行耐药基因检测发现，携带耐药基因的现象已经非常普遍，本研究所检测的6株临床分离的沙门氏菌中，TEM、SHV、ddA1、aacC2、aacC4、qnrB 和 qnrS 均有较高的检出率，这与药物敏感试验的结果和目前临床用药的情况是基本上一致[5]。β-内酰胺类、氨基糖苷类的各3种耐药基因均检出，而氟喹诺酮3种耐药基因只检测出qnrB和qnrS，未能检测到耐药基因qnrA。当然，即使检测出了分离菌株所携带的耐药基因也不一定对该类药物高度耐药，药敏试验中度敏感的菌株也可能扩增出相应的耐药基因[6]，可能是因为该耐药基因在表达过程中受到某种因素抑制而不出现耐药表型，或者是由于其它因素的影响而使该基因暂时、长久散失或功能减弱，也可能是因为该基因表达的条件还未成熟，处于沉默基因[7]。耐药基因的检测有助于了解该规模化养猪场沙门氏菌流行株耐药基因存在的种类、数量及流行规律，从而丰富和完善猪源致病性沙门氏菌耐药性的分子流行病学资料。通过对规模化养猪场临床分离到的猪源沙门氏菌的药敏试验和耐药基因的检测，能够更好地指导临床用药，以降低细菌的耐药性。