过表达SIRT1对脊神经结扎大鼠病理性疼痛的影响及机制

华雷，周外平，李梦杰

(武汉市第四医院，武汉 430033)

神经病理性疼痛属于慢性疼痛，一般表现为自发性疼痛、痛觉异常以及痛觉过敏[1]。细胞沉默信息调节因子1(SIRT1)具有较强的去乙酰化作用，主要参与糖脂代谢、细胞周期调控、细胞凋亡等生理过程。研究表明，SIRT1抑制剂能加速足部甲醛炎症疼痛，而激活SIRT1表达后可降低足部炎症疼痛[2,3]。体外SIRT1过表达可减轻内毒素所致神经元轴突变性，缓解脊髓疼痛[4]。然而关于SIRT1抑制神经性疼痛机制目前研究不多。本研究通过制备脊神经结扎(SNL)模型，经鞘内注射过表达SIRT1载体，探究其对大鼠病理性疼痛及神经元凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级雄性SD大鼠54只，8周龄，体质量220～260 g，购于河南省动物实验中心，许可证号：SYXK(豫)2016-0002。所有大鼠在统一环境内饲养，室内温度25 ℃，相对湿度45%～60%，昼夜交替12 h，自由摄食、饮水，严格遵循国家动物饲养规则，动物疼痛实验经本院动物伦理委员会批准同意。兔抗鼠SIRT1、乙酰化组蛋白H3(Ac-H3)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax、β-actin、山羊抗兔二抗(博奥森生物科技有限公司)、pAd/PL腺病毒载体(Invitrogen公司，美国)，免疫荧光显微镜、垂直电泳仪(Bio-Rad公司，美国)，鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA检测试剂盒(Simga公司，美国)；蛋白提取试剂盒、BCA检测试剂盒(索莱宝科技有限公司，中国)；机械痛阈测量仪及热辐射痛阈检测仪(UGO BASILE公司，意大利)，透射电镜(Tecnai公司，荷兰)。

1.2 模型制备及分组 大鼠均经腹腔注射2%戊巴比妥50 mg/kg麻醉，经L4、L5脊椎间隙将PE-10导管(20 cm)插入2 cm，经皮下隧道至颈部导出后于皮肤后方固定，采用热熔风封口。鞘内置管成功后，参照文献[5]方法进行SNL模型制备，大鼠麻醉后分离脊柱组织，暴露左侧L4、L5横突，将部分L5横突去除，暴露L4～L5脊神经，采用非吸收外科线结扎L5脊神经并在远端切断。将大鼠随机分为假手术组、Cont-shRNA组、SIRT1-shRNA组，每组18只。将阴性对照序列Cont-shRNA与SIRT1-shRNA序列克隆至腺病毒载体中，分别获得含Cont-shRNA、SIRT1-shRNA的腺病毒载体。假手术组仅暴露脊神经不进行结扎处理，经鞘内注射25 μL生理盐水，每天注射1次，连续7 d；Cont-shRNA、SIRT1-shRNA组模型制备成功后鞘内分别注射25 μL的Cont-shRNA、SIRT1-shRNA，均每天注射1次，连续7 d。

1.3 大鼠行为学测定 于第1、3、7 天时，各组分别取大鼠6只，置于玻璃箱用Von-Frey 纤维丝刺激足中底部至大鼠出现缩足或舔足反应，连续测量3次，记录大鼠机械刺激缩足反应阈值(PWT)，取平均值。将大鼠置于热辐射痛阈检测仪，加大电源辐射刺激大鼠足底部，当出现缩足或舔足反应，连续测量3次，间隔时间5 min，记录开启电源至出现热刺激缩足反应潜伏期所用时间(PTWL)。大鼠行为学测定后，麻醉放血处死，收集血液及脊髓腰膨大组织，置于-80 ℃中保存。

1.4 脊髓组织中SIRT1蛋白、Ac-H3蛋白表达检测 采用免疫印迹法。取出冷冻脊髓组织研磨后用裂解液裂解、提取总蛋白，检测蛋白浓度后，SDS-PAGE电泳分离等量蛋白，转膜反应、封闭后，添加一抗(1∶500)4 ℃过夜，添加二抗(1∶5 000)室温放置1 h，ECL显色后凝胶成像仪中观察并计算蛋白表达。

1.5 脊髓组织中TNF-α、IL-1β、IL-6表达检测 采用ELISA法。用酶联免疫吸附法检测脊髓组织中TNF-α、IL-1β、IL-6表达，严格参照试剂盒说明操作。称取0.1 g脊髓组织，加生理盐水0.9 mL，置于匀浆器中制备组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，保存上清。设置空白孔(仅添加显色溶液、终止液)、样品孔，样品孔中添加100 μL组织匀浆上清，室温下封板孵育2 h，洗涤、拍干后添加100 μL生物素化抗体，洗涤、拍干后添加100 μL HPR反应液，室温下封板后避光孵育20 min，洗涤、拍干后，添加显色剂避光孵育15～20 min，添加50 μL终止液结束反应，450 nm波长处测定吸光度值，绘制标准曲线计算样品浓度。

1.6 脊髓背角星形胶质细胞活化情况观察 采用免疫荧光染色法。制备脊髓组织冷冻切片，加入TritonX-100放置30 min，山羊血清封闭37 ℃孵育1 h，添加GFAP一抗4 ℃中孵育过夜，加入FITC标记二抗37 ℃孵育1 h，置于荧光显微镜下观察蛋白荧光强度，同时统计星形胶质数目。

1.7 脊髓神经元超微结构观察 脊髓组织切片于3%戊二醛中固定，再次置于1%锇酸内固定、乙醇中水合，包埋后行醋酸铀-枸橼酸铅双染色后置于透射电子显微镜下观察神经元超微结构变化。

1.8 脊髓组织中凋亡蛋白Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3 表达检测 采用免疫印迹法检测Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3 蛋白表达。将脊髓组织研磨后添加裂解液裂解，提取脊髓组织总蛋白，BCA法测定蛋白含量后，SDS-PAGE电泳分离目的蛋白，将蛋白转移至PVDF膜，添加山羊血清封闭，添加一抗(1∶500)4 ℃过夜，添加二抗(1∶5 000)37 ℃孵育1 h，ECL发光显影后凝胶成像仪中观察并计算蛋白表达。

2 结果

2.1 三组不同时点脊髓组织中SIRT1蛋白、Ac-H3蛋白表达比较 见表1、2。

表1 三组不同时点脊髓组织中SIRT1蛋白表达比较

注：与假手术组相比，*P<0.05；与Cont-shRNA组相比，#P<0.05。

表2 三组不同时点脊髓组织中Ac-H3蛋白表达比较

注：与假手术组相比，*P<0.05；与Cont-shRNA组相比，#P<0.05。

2.2 三组不同时点PWT、PTWL比较 见表3、4。

表3 三组不同时点PWT比较

注：与假手术组相比，*P<0.05；与Cont-shRNA组相比，#P<0.05。

表4 三组不同时点PTWL比较

注：与假手术组相比，*P<0.05。

2.3 三组脊髓背角星形胶质细胞活化情况 假手术组脊髓背角GFAP蛋白正常表达，荧光较弱，胞体不明显；干预第1 天，Cont-shRNA组GFAP蛋白荧光亮度增强，第3、7 天星形胶质细胞体积增大；与Cont-shRNA组相比， SIRT1-shRNA组GFAP蛋白荧光亮度减弱，星形胶质细胞体积变小。三组不同时点脊髓背角GFAP阳性细胞数比较见表5。

表5 三组不同时点脊髓背角GFAP阳性细胞数比较(个，

注：与假手术组相比，*P<0.05；与Cont-shRNA组相比，#P<0.05。

2.4 三组脊髓背角GFAP蛋白表达比较 见表6。

表6 三组脊髓背角GFAP蛋白表达比较

注：与假手术组相比，*P<0.05；与Cont-shRNA组相比，#P<0.05。

2.5 三组不同时点脊髓组织中TNF-α、IL-1β、IL-6表达比较 见表7～9。

表7 三组不同时点脊髓组织中TNF-α表达比较

注：与假手术组相比，*P<0.05；与Cont-shRNA组相比，#P<0.05。

表8 三组不同时点脊髓组织中IL-1β表达比较

注：与假手术组相比，*P<0.05；与Cont-shRNA组相比，#P<0.05。

表9 三组不同时点脊髓组织中IL-6表达比较

注：与假手术组相比，*P<0.05；与Cont-shRNA组相比，#P<0.05。

2.6 电镜下脊髓背角神经元结构变化 假手术组第1、3、7 天神经元细胞核表面光滑呈现圆形，细胞核中染色质明显，细胞质内核糖体、线粒体等形态正常，均匀分布。Cont-shRNA组第1 天神经元肿胀，线粒体、内质网等肿胀裂解，第3、7 天时神经元出现皱缩、变形，细胞核固缩，染色质浓缩贴于核膜边，呈现凋亡状。SIRT1-shRNA组第3 天，神经元异形程度明显减轻，染色质缩短程度以及核膜边集程度减轻。见图1。

图1 电镜观察脊髓背角神经元超微结构(10 000×)

2.7 三组不同时点脊髓背角组织中凋亡相关蛋白表达比较 见表10。

表10 三组不同时点脊髓背角组织中凋亡相关蛋白表达比较

注：与假手术组相比，*P<0.05；与Cont-shRNA组相比，#P<0.05。

3 讨论

组蛋白乙酰化属于表观遗传学研究重要内容，组蛋白发生乙酰化时，可抑制或促进基因转录，进而在肿瘤、应激、创伤等病理过程中发挥调控作用。SIRT1属于组蛋白去乙酰化酶，通过对底物进行去乙酰化调控，参与细胞增殖、凋亡、周期调控等生理过程。在人胚肾细胞中发现，SIRT1通过抑制启动子Bclaf1激活进而抑制T细胞活化，此作用通过介导组蛋白56位赖氨酸去乙酰化作用实现[6]。在急性肾缺血再灌注模型中研究发现，髓质外层中SIRT1表达明显增加，此与组蛋白去乙酰化水平下降密切相关[7]。近期研究发现，乙酰化平衡状态的破坏与神经病理性疼痛密切相关,采用去乙酰化抑制剂治疗肿瘤患者，疼痛增强，而停止治疗则可减轻疼痛，表明去乙酰化抑制剂的使用与患者疼痛增强密切相关[8]。Shao等[9]研究发现，激活脊髓SIRT1后可缓解减轻小鼠神经病理性疼痛。王依慰等[10]发现，白藜芦醇可通过激活SIRT1,促进p65去乙酰化缓解神经病理性疼痛。然而SIRT1去乙酰化是否影响SNL大鼠病理性疼痛，目前尚不明确。

本研究结果发现，与假手术组相比，干预第 1、3、7天， Cont-shRNA组SIRT1蛋白表达降低，差异有统计学意义，而与Cont-shRNA组相比，SIRT1-shRNA组SIRT1蛋白表达升高，差异有统计学意义，表明SIRT1序列成功在小鼠脊髓组织中高表达。进一步研究分析Cont-shRNA组大鼠行为学指标PWT、PTWL降低，SIRT1-shRNA组PWT、PTWL升高，表明上调SIRT1表达后能缓解大鼠病理性疼痛。进一步对组蛋白检测发现上调SIRT1表达可明显降低Ac-H3表达，提示SIRT1可能通过调控组蛋白乙酰化水平参与神经病理性疼痛的发生发展。

研究表明，星形胶质细胞在神经信号传递中发挥重要作用，且星形胶质细胞的持续激活与神经病理性疼痛密切有关，阻断细胞激活可一定程度上减轻病理性疼痛[11,12]。GFAP为星形胶质细胞激活标志物[13]。本研究免疫荧光结果显示，与假手术组相比，Cont-shRNA组脊髓背角星形胶质细胞体积增大，荧光亮度增强，且GFAP阳性细胞数随处理时间的延长逐渐增多，而SIRT1-shRNA组星形胶质细胞体积增加不明显，荧光强度减弱，且GFAP阳性细胞数减少，表明过表达SIRT1可抑制星形胶质细胞活化，降低其标志物的表达，过表达SIRT1可能通过抑制星形胶质细胞的活化进而缓解神经病理性疼痛。

胡传银等[14]研究显示，L5SNL神经疼痛模型中脊髓胶质细胞内MAPK信号通路激活后可刺激下游炎症因子活化如TNF-α、IL-1β、IL-6，作用于脊髓后角神经元，继续加重神经病理性疼痛。研究显示，大鼠神经病理性疼痛模型中胶质细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白表达升高，采用TNF-α抑制剂预处理后则大鼠疼痛行为得到明显缓解[18]。本研究结果显示，Cont-shRNA组脊髓组织中TNF-α、IL-1β、IL-6表达明显升高，而SIRT1-shRNA组脊髓组织中TNF-α、IL-1β、IL-6表达明显降低，提示过表达SIRT1可减轻大鼠神经病理性疼痛，此可能与抑制TNF-α、IL-1β、IL-6表达有关。

赵伟等[16]研究发现，SNL动物模型中存在神经元凋亡，导致γ -氨基丁酸减少，加速神经兴奋，参与神经病理性疼痛的发生发展，采用Caspase抑制剂处理后可显著抑制神经元凋亡，减轻病理性疼痛。此外，有研究还发现坐骨神经结扎大鼠给予Caspase抑制剂后可明显缓解病理性疼痛，此可能与降低脊髓背角神经元凋亡、抑制神经生长因子有关[17]。本研究电镜结果显示，Cont-shRNA组神经元肿胀，线粒体、内质网等肿胀裂解，3、7 d时神经元出现皱缩、变形，细胞核固缩，染色质浓缩贴于核膜边，呈现凋亡状，SIRT1-shRNA组神经元异形程度明显减轻，染色质缩短程度及核膜边集程度减轻，提示过表达SIRT1可能抑制神经元凋亡。研究显示,沉默SIRT1后可下调Bcl-2蛋白、上调Bax及cleaved-Caspase-3 蛋白表达，抑制BDNF对神经元的凋亡[18]。本研究结果显示，与假手术组相比，干预后1、3、7 d Cont-shRNA组 Bcl-2蛋白表达降低，Bax、cleaved-Caspase-3 蛋白表达升高，SIRT1-shRNA组Bcl-2蛋白表达升高，Bax、cleaved-Caspase-3 蛋白表达降低，提示过表达SIRT1后可影响凋亡蛋白的表达进而影响神经元凋亡。

综上所述，SNL大鼠过表达SIRT1后，通过抑制星形胶质细胞活化，降低神经元凋亡缓解SNL大鼠病理性疼痛，然而SNL神经病理性疼痛发生机制较复杂，SIRT1是否还可能通过影响其他途径发挥作用，有待进一步深入探究。