热应激预处理减轻高温环境对大鼠学习记忆功能损伤作用的试验

施江敏 ,黄圆圆 ,朱慧敏 ,吴雨佳 ,刘 洋 ,吕士杰 ,高俊涛

(1.吉林医药学院临床医学院,吉林吉林132013 ;2.延边大学医学院生物化学与分子生物学教研室,吉林延吉133002 ;3.吉林医药学院基础医学院,吉林吉林 132013)

近年来,在全球变暖的大背景下,我国乃至全球极端天气频发,多地出现大范围热浪袭击[1]。高温环境造成心血管系统、消化系统、泌尿系统等的非特异性损伤[2],增加多种疾病的发病率和病死率,已成为危害人体健康的重要危险因素[3],但高温环境对神经系统尤其是学习记忆能力方面研究较少。有研究表明,高温环境对人体注意力[4],记忆力[5]和信息处理能力[6]等方面产生不利影响,因此,研究热应激预处理对学习记忆功能的保护作用及其机制是很有必要的。本试验从行为学及分子水平出发,观察高温暴露后大鼠海马区炎症因子分泌的变化,探讨神经炎症是否参与高温损伤学习记忆功能的调控,旨在为高温损伤大脑认知功能提供新的理论依据,同时为抗高温机制研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级Wistar 大鼠(辽宁长生生物技术股份有限公司)45 只,雄性,体重(180 ±20)g,动物许可证号:SCXK(辽)2015-0001。动物试验经吉林医药学院伦理委员会批准进行(批准号:20150316)。

1.2 仪器与试剂 DKB-501S 型超级恒温水浴(上海精宏实验设备有限公司),550 型酶标仪(美国Bio-Rad 公司),RMT-100 型八臂迷宫视频分析系统(成都泰盟科技有限公司),OFT-100 型开场活动实验系统(成都泰盟科技有限公司),白介素-1β ELISA 检测试剂盒(批号:20170618)、肿瘤坏死因子-αELISA 检测试剂盒(批号:20170618)、诱导型一氧化氮合酶检测试剂盒(批号:20170622)和总一氧化氮合酶检测试剂盒(批号:20170622),均购自美国Minneapolis 公司。

1.3 动物分组与处理 将45 只Wistar 大鼠随机分成正常对照组,热应激模型组和热应激预处理组。使用超级恒温水浴,连接自制有机玻璃夹层水循环舱,保持室温23～24 ℃,热循环舱温度42 ℃,相对湿度40%～60%,风速0～0.2 m/s,稳定1 h 以上。正常对照组置于室温(24 ℃)环境中;热应激模型组置于42 ℃热舱中30 min;热应激预处理组置于42 ℃热舱中,预处理10 min/d,连续15 d,然后置于42 ℃热舱中30 min。

1.4 学习记忆功能检测

1.4.1 八臂迷宫试验 大鼠每日空腹12 h。第1 -2 天,迷宫各臂及中央区分撒着食物颗粒(每臂1粒,直径约4～5 mm),每次将1 只大鼠置于迷宫中央(通往各臂的门打开),让其自由摄食、探究10 min。第3 天开始训练,在1,2,4,7 臂内放置食物颗粒,每次将1 只大鼠置于迷宫中,由其自由选择进入放射状臂觅食,直至10 min 末或提前完成所有臂的觅食,即结束一次训练。测试指标:(1)潜伏期,即大鼠吃完所有食粒所花的时间;(2)工作记忆错误,即在同一次训练中大鼠再次进入已经吃过食粒的臂的次数;(3)参考记忆错误,即动物进入不曾放过食粒的臂的次数;(4)总错误次数,即工作记忆错误和参考记忆错误总和。连续5 次训练的工作记忆错误为0、参考记忆错误不超过1 次时,表明训练成功。

1.4.2 旷场试验 试验箱底部画有9 个虚拟的、等大的正方格,包括沿侧壁的外周格(8 个)和中间的中央格(1 个)。试验开始时,操作者将大鼠放在正中央区,系统开始同步自动记录大鼠5 min 内在实验箱里的活动。测试指标:(1)水平运动,即某一肢体越过的水平格子数;(2)垂直运动,即后肢站立次数。

1.5 炎症因子检测 取每组大鼠海马组织,采用相关试剂盒测定白介素1β(Interleukin 1 beta,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-alpha,TNFα)、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)和总一氧化氮合酶(Total nitric oxide synthase,tNOS)含量,具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 统计学分析 采用SPSS 11.5 软件处理数据,计量资料以()表示,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 八臂迷宫潜伏期和工作记忆错误次数 与正常对照组比较,热应激模型组潜伏期和工作记忆错误次数明显升高(P<0.05);与热应激模型组比较,热应激预处理组潜伏期和工作记忆错误次数明显降低(P<0.05)。可见高温损伤大鼠的学习记忆能力明显降低,热应激预处理能够降低损伤程度(见表1)。

表1 各组大鼠八臂迷宫潜伏期、工作记忆错误次数比较(,n=15)

表1 各组大鼠八臂迷宫潜伏期、工作记忆错误次数比较(,n=15)

与正常对照组比较,∗: P<0.05,∗∗: P<0.01; 与热应激模型组比较,#: P<0.05,##:P<0.01;下表同

2.2 八臂迷宫参考记忆错误次数和总错误次数与正常对照组比较,热应激模型组参考记忆错误次数和总错误次数明显升高(P<0.05);与热应激模型组比较,热应激预处理组参考记忆错误次数和总错误次数明显降低(P<0.05)。可见高温损伤大鼠的学习记忆能力明显降低,热应激预处理能够降低损伤程度(见表2)。

表2 各组大鼠八臂迷宫参考记忆错误次数、总错误次数比较(,n=15)

表2 各组大鼠八臂迷宫参考记忆错误次数、总错误次数比较(,n=15)

2.3 旷场试验 热应激模型组、热应激预处理组、正常对照组水平运动得分、垂直运动得分无统计学差异(P>0.05)(见表3)。

表3 各组大鼠旷场试验水平运动、垂直运动得分比较(,n=15)

表3 各组大鼠旷场试验水平运动、垂直运动得分比较(,n=15)

2.4 酶联免疫吸附试验结果 与正常对照组比较,热应激模型组大鼠海马组织中IL-1β(P<0.01)、TNF-α(P<0.05)、iNOS(P<0.01)和tNOS(P<0.05)水平显著升高;与热应激模型组比较,热应激预处理组大鼠海马组织中IL-1β(P<0.01)、TNF-α(P<0.05)、iNOS(P<0.05))水平显著降低。说明高温导致炎症因子的升高,热应激预处理能够减轻海马组织炎症反应(见表4)。

表4 各组大鼠海马组织IL-1β、TNF-α、iNOS、tNOS 含量比较(,n=15)

表4 各组大鼠海马组织IL-1β、TNF-α、iNOS、tNOS 含量比较(,n=15)

3 讨论

学习记忆功能是大脑重要的高级神经功能之一,是中枢神经系统功能的整合。大量研究涉及与热应激有关的生理反应,但热应激对学习记忆功能的影响仍存在争议。不同的试验方法难以确定热本身导致认知缺陷以及热与认知的关系[7]。八臂迷宫可以有效地反映大鼠空间学习记忆功能[8],试验中热应激模型组潜伏期、工作记忆错误、参考记忆错误、总错误次数均明显高于正常对照组,表明热应激模型组大鼠学习记忆能力下降,这与其他研究结果及临床观察相一致[9-10]。热应激模型组潜伏期10 d 后才明显上升,说明热应激损害学习记忆能力并没有立刻发生,这与Morley J 认为高温环境引起的学习记忆改变不会在高热暴露后立即产生的结果一致[11],而高温环境引起的其他认知功能(如注意力,反应时间等)受损发生于体温升高后的1 -2 h[11-12],热应激预处理能够延缓这一过程。工作记忆错误反映了大鼠短时记忆损伤程度,试验表明,热应激对大鼠短时记忆产生影响。参考记忆错误反映了大鼠长时记忆损害程度,热应激模型组的长时记忆损伤严重程度不仅体现在损伤速度,而且体现在损伤程度上,随着暴露时间的增加,长时记忆损伤程度加重,而热应激预处理能够延缓损伤的发生并减轻损伤程度。热应激导致全身性炎性反应[13-14]:热应激导致炎性细胞因子如IL-6、TNF-α在血液中的含量增加[15]。持续的热应激使机体诱导免疫反应,机体白细胞、血小板含量增加[16],诱导导核因子NF-κB 活化[17],激活神经胶质细胞并使其释放炎性分子和细胞毒性因子,如环氧酶-2(COX-2)、iNOS 衍生物,TNF-α,IL-1β 等[18],进而导致神经元和突触损伤,TNF-α 和IL-1β 抑制成体神经干细胞的增殖和认知功能[19]。神经炎症因子上调所致学习记忆功能的降低越来越引起人们的关注,是导致学习记忆能力下降的一个重要机制。高温环境可显著增加海马炎症反应[17],导致记忆障碍,与本试验结果相一致。本试验研究发现,高温环境后大鼠海马组织内的炎症因子含量也升高,可见高温环境介导的神经炎症反应参与学习记忆下降的神经调控过程。热应激预处理通过减轻炎症反应降低高温热应激对学习记忆功能的损伤作用,这种保护作用与炎症反应密切相关。大鼠旷场试验是一种经典地反映在大鼠在新环境中的探究行为及情绪反应的动物试验方法,水平运动得分情况能反应大鼠的自主活动性,垂直运动得分情况可反应大鼠对新鲜环境的好奇度,本试验中,热应激模型组大鼠的水平运动和垂直运动得分与正常对照组无统计学差异,表明本试验条件下热应激没有改变大鼠的自主活动,此结果与Minho Moon 等人的试验结果一致[20]。旷场试验表明,本试验中热应激引起的学习记忆能力改变,并非由自主活动行为改变引起。综上所述,长期高温暴露可损伤大鼠的认知功能尤其是学习记忆能力障碍,并且随着暴露时间的增加而加重,长期高温暴露引起学习记忆功能损伤可能与免疫反应、炎症反应、血脑屏障通透性增高和脑缺血等有关,热应激预处理通过减轻炎症反应延缓学习记忆功能降低进程,减轻损伤程度,相关的机制有待进一步深入研究。