雏鸡源致病性奇异变形杆菌的鉴定与药敏试验

庞洪泽 ,张召兴,2 ,张海龙 ,李佩国 ,李蕴玉 ,贾青辉 ,张香斋

(1.河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室,河北秦皇岛066604 ;2.河北旅游职业学院畜牧兽医系,河北承德 067000)

奇异变形杆菌属于肠杆菌科变形杆菌属中的兼性厌氧革兰阴性杆菌,该菌具有菌毛和鞭毛结构,具有运动性,不形成荚膜和芽孢,主要分布污水、土壤、粪便及动物的体内[1-2]。奇异变形杆菌可以感染鸡、猪、山羊、奶牛等多种动物及人,是临床中一种常见的条件性致病菌[3-4]。鸡奇异变形杆菌病是由致病性奇异变形杆菌引起不同日龄鸡的一种急性传染性疾病,主要临床特征为败血症、水样腹泻、一侧或两侧腿麻痹,主要危害7 周龄以下的雏鸡,其发病率和死亡率较高,而愈后的雏鸡生长缓慢,给养鸡业造成严重的经济损失[5-6]。

2017 年10 月,秦皇岛地区某鸡场,9 日龄的雏鸡发病,病鸡精神不振,体温升高,排水样的腹泻,在腹泻后的1 至3 天内出现死亡。为确定引起雏鸡死亡的病原菌,无菌采集病死雏鸡病料组织进行病原菌分离鉴定和药敏试验,为该病的防治提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源 秦皇岛地区某鸡场9 日龄病死的雏鸡,无菌采集病死鸡肝脏组织。

1.2 主要试剂与设备普通营养培养基、S.S.培养基、营养肉汤、革兰染色液试剂盒,均购自青岛高科园海博生物技术有限公司;药敏纸片,购自北京天坛药物生物技术开发公司;生化鉴定试纸条,购自北京中生瑞泰科技有限公司;DL-2 000 Marker、2 ×TaqMarker Mix,均购自北京康为世纪生物科技有限公司。梯度PCR 由仪德国eppendorf 公司生产;隔水式恒温培养箱购自上海一恒科技仪器有限公司;ATB 自动化微生物生化鉴定系统由法国生物梅里埃股份有限公司生产。

1.3 试验动物 健康9 日龄海兰褐雏鸡10 只,购自秦皇岛市金牧种鸡场。

1.4 细菌分离培养与鉴定 无菌采集病死雏鸡肝脏组织划线接种于普通营养琼脂培养基,37 ℃恒温培养12 -18 h,挑取优势单个菌落分别接种于S.S.琼脂平板,37 ℃恒温培养12 -18 h。挑取单个菌落接种于营养肉汤中进行纯化培养,取纯化培养的分离菌株革兰染色,显微镜下观察细菌形态。

1.5 生化试验鉴定 将纯化培养的分离菌株按照说明书接种于肠杆菌科生化鉴定试纸条中,37 ℃恒温培养12 -24 h,用ATB 自动化微生物生化鉴定系统进行生化特性鉴定。

1.6 细菌的16S rRNA PCR 鉴定及测序 参考文献[7]设计细菌16S rRNA 序列,设计的通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用水煮方法提取细菌DNA 组,进行PCR 鉴定。PCR 扩增反应体系为50 μL:2 ×TaqMix 25 μL,上、下游引物各2 μL,DNA 模板3 μL,ddH2O 18 μL。反应条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性50 s,57.5 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30 个循环,72 ℃延伸10 min。取出5 μL 扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行检测正确后,将PCR 产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定,测序结果与GenBank 数据库中登录基因序列进行同源性比较与分析。

1.7 致病性试验 调整分离菌株菌液浓度为108CFU/mL,将10 只9 日龄健康雏鸡分为2 组,每组5只,试验组每只雏鸡腹腔注射0.25 mL(108CFU/mL),对照组每只雏鸡给予等量的生理盐水,攻毒12 h 后,观察7 d,记录每组的发病情况和死亡情况。

1.8 药敏试验 参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的标准K-B 纸片法进行试验操作和结果判断。

2 结果

2.1 细菌分离培养 分离菌株在普通营养琼脂培养基上生长出圆形、扁平的、半透明或者透明的菌落,随培养时间的延长,菌落的边缘有迁徙生长现象;在S.S.琼脂培养基上生长出圆形、光滑、边缘整齐、中心带有黑心的无色透明的菌落;革兰染色镜检显示,分离菌株为革兰阴性菌,两端钝圆杆状菌。

2.2 生化鉴定结果 分离菌株可发酵半乳糖、葡萄糖、木糖产酸产气,甲基红试验、V-P 试验、过氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、尿素酶阳性;吲哚试验、氧化酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水酶为阴性;产生H2S。用ATB 自动化微生物生化鉴定系统鉴定为奇异变形杆菌,评定结果合格率为99.9%。

2.3 致病性试验结果 试验组雏鸡接种12 -24 h后,雏鸡出现不同程度的死亡,至72 h 雏鸡全部死亡。在死亡雏鸡肝脏中分离到奇异变形杆菌,对照组的雏鸡健康存活,从而证实所分离的奇异变形杆菌具有很强的致病性。

2.4 细菌的16S rRNA PCR 鉴定结果 用16S rRNA 的通用引物对分离菌株进行PCR 检测,扩增出大约为1 500 bp 的目的条带(图1),与预期片段相符合。将测序结果与GenBank 基因序列数据库中基因序列进行比对,与已发表的奇异变形杆菌的基因序列匹配度高达99%以上。因此,确定了分离菌株为奇异变形杆菌。

图1 分离菌株16S rRNA PCR 扩增结果

2.5 药敏试验 结果见表1,分离菌株对头孢曲松、头孢克肟、环丙沙星、丁胺卡那霉素、林可霉素5种药物敏感;对头孢拉啶、恩诺沙星、新霉素、大观霉素4 种药物中敏;对氨苄西林、阿莫西林、青霉素、氟苯尼考、庆大霉素、多西环素、多粘菌素7 种药物耐药。

表1 药敏试验结果

3 讨论

奇异变形杆菌是一种常见的条件性致病菌,广泛分布于动物和人的体表、黏膜及消化道内,该菌在动物的消化道可以产生毒素,导致动物中毒,不仅可以感染鸡、山羊、奶牛和猪等多种常见畜禽,也可感染狐狸、熊猫、水貂、猕猴等多种野生动物,当动物机体抵抗力下降时,能够引起动物泌尿系统感染、腹泻、菌血症、败血症等[8]。鸡奇异变形杆菌病是近几年发生的一种细菌性急性传染病,种鸡感染奇异变形杆可以通过垂直传播给后代,对雏鸡最易感,感染率和死亡率均较高[3]。近几年,我国关于雏鸡奇异变形杆菌病的报道愈来愈多。周芳等[5]报道了从10 日龄的雏鸡体内分离到了致病性奇异变形杆菌。杨金丽等[6]报道了在50 日龄的肉鸡中分离到致病性奇异变形杆菌。朱明华等[9]报道了从山东泰安一鸡场发病雏鸡眼中分离到1 株致病性奇异变形杆菌。本试验从9 日龄腹泻致死的雏鸡体内分离到奇异变形杆菌,并且对雏鸡具有很强的致病性。

奇异变形杆菌血清型众多,疫苗免疫预防难度比较大,因此,抗菌药物成为防治鸡奇异变形杆病主要的方法。随着鸡奇异变形杆菌病发生与流行,临床上由于不合理使用抗菌药物,导致奇异变形杆菌耐药菌株不断地出现,并且产生很强的耐药性[10]。本药敏试验表明,分离菌株对头孢克肟、头孢曲松、环丙沙星、丁胺卡那霉素、林可霉素5 种药物高度敏感;对其他药物存在不同程度耐药性。由于奇异变形杆菌具有易产生耐药性特点,当发生该病时,应该通过药敏试验分析其耐药性,合理使用抗菌药物,提高治疗疗效。同时加强平时的饲养管理,减少环境中的诱因。