HBV-M定性与HBV-DNA定量联合检测在诊治乙型肝炎中的临床价值

(河南省南阳市第一人民医院核医学科， 河南 南阳 473000)

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)所致肝脏疾病，临床表现复杂，若未及时处理或处理不当，可演变为肝硬化，严重者会危及患者生命[1]。本病的诊断主要依赖于HBV感染5项血清免疫标志物，可直观反映患者免疫应答状态，但其无法直接反映HBV在人体内复制情况[2]。新近研究表明，HBV感染后，外周血中乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)的检出能反映完整的HBV颗粒释放，是反映病毒复制最直接、可靠指标[3]。现阶段，荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR)技术在基因诊断中凸显巨大优势，其能高效检出HBV感染和复制情况，为临床诊治工作提供参考信息[4]。本研究选取我院900例乙型肝炎患者进行研究，旨在探究乙型肝炎病毒-标志物(HBV-M)不同模式下FQ-PCR技术在HBV-DNA定量检测中的诊断价值，详情如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年1月—2018年9月我院收治的900例乙型肝炎患者作为研究对象。其中男567例，女333例；年龄18～68岁，平均(43.01±11.97)岁；病程1～5年，平均(3.01±0.84)年；临床症状体征：412例上腹部不适，304例肝区痛，522例食欲减退，489例乏力。本研究经医院伦理委员会批准通过。

1.2 选取和排除标准 ①纳入标准：根据《慢性乙型肝炎诊断标准(2015年版)》[5]诊断为乙型肝炎患者；Knodell肝组织活动指数(HAI)≥4；丙氨酸基转移酶(ALT)≥2×ULN(ULN=40 U/L) ；近期未接受抗病毒治疗者；患者与家属知晓并签署同意书。②排除标准：心、肾等脏器功能障碍者；甲、丙、丁、戊型肝炎者；精神疾病者；妊娠或哺乳期妇女者；酗酒和吸毒史者；以往1个月内接受抗病毒治疗者；依从性差，无法配合研究者。

1.3 检测方法 ①标本采集。所有患者均于清晨采集6 ml空腹肘静脉血，分为2份，各3 ml，室温下放置30 min，3000 r/min，离心10 min，保存于-20℃冰箱内待测。②HBV-M模式定性检测。应用酶联免疫吸附法(ELISA)对血液标本进行HBV-M模式定性检测，检测顺序为HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，结合上海热电MK 3型酶标仪评估结果，试剂盒购自上海抚生实业有限公司，完全参照试剂盒说明书操作。③HBV-DNA定量检测。选用中山大学达安基因诊断中心生物工程公司生产的DA 7600 PCI仪，取200 μl样品，滴加DNA提取液Ⅰ450 ml、内标溶液4 μl，振荡混匀，15 s后瞬时离心数秒，100℃恒温处理(10±1) min，12 000 r/m离心5 min，备用，并做临界阳性、阴性、强阳性质控品。取2 μl上清液放入FQ-PCR反应管进行扩增，扩增条件：94℃ 2 min，随后94℃变性10 s，60℃退火，延伸30 s，共40个循环，上述操作完成后，电脑自动计算分析HBV-DNA定量结果，每次试验设置4个HBV-DNA标准品系列浓度，>1.00×103拷贝/毫升即为阳性结果。

2 结果

2.1 HBV-M定性检测结果 900例乙型肝炎患者的血液标本中，HBV-M模式定性检测含8种模式，271例HBsAg+HBeAg+HBcAb，347例HBsAg+HBeAb+HBcAb，130例HBsAg+HBeAb，26例HBsAg+HBeAg，34例HBsAb+HBeAb+HBcAb，18例HBsAb+HBeAb，27例HBeAb+HBcAb，47例HBcAb。

2.2 HBV-DNA定量检测结果 900例乙型肝炎患者的血液标本，HBV-DNA检测阳性率为55.00%(495/900) 。

2.3 不同HBV-M模式下HBV-DNA检测结果 HBsAg+HBeAg+HBcAb模式下HBV-DNA阳性率高于HBsAg+HBeAb+HBcAb、HBsAg+HBeAb、HBsAb+HBeAb+HBcAb模式(χ2=265.483，P<0.001；χ2=112.295，P<0.001；χ2=238.421，P<0.001)；HBsAg+HBeAg模式阳性率明显高于HBsAg+HBeAb+HBcAb、HBsAg+HBeAb、HBsAb+HBeAb+HBcAb模式(χ2=33.162，P<0.001；χ2=9.992，P=0.001；χ2=41.489，P<0.001)。HBsAg+HBeAg+HBcAb模式的HBV-DNA含量明显高于HBsAg+HBeAg、HBsAg+HBeAb+HBcAb、HBsAg+HBeAb、HBsAb+HBeAb+HBcAb模式(t=63.823，P<0.001；t=452.939，P<0.001；t=369.598，P<0.001；t=217.838，P<0.001)。见表1。

表1 比较不同HBV-M模式下HBV-DNA检测结果

注：与HBsAg+HBeAg+HBcAb模式HBV-DNA阳性率比较，a：P<0.05，b：P<0.001；与HBsAg+HBeAg模式HBV-DNA阳性率比较，c：P<0.001，d：P<0.01；与HBsAg+HBeAg+HBcAb模式HBV-DNA含量比较，e：P<0.0001

3 讨论

HBV感染具有发病率高、传染力强等特征，感染HBV后，部分乙型感染患者会演变为慢性肝炎，甚至继发肝炎、肝癌等疾病，现已成为全球严重公共卫生问题之一[6-7]。由此可见，早期诊断HBV感染并给予治疗，在延缓病情进展、改善预后等方面意义重大。

目前，本病检测方法多种多样，如ELISA法、FQ-PCR技术定量检测、放射免疫法等，其中ELISA法仅能反映HBV病毒免疫应答状态，对机体HBV感染复制及传染危险性反映不准确，FQ-PCR作为HBV-DNA最直接参考指标，能动态、直接反应HBV病毒复制状态及危险性，但HBV-DNA定量受核苷类药物及实验条件影响较大，无法真实反映肝细胞内HBcAg定量[8-10]。高娟等[11]学者主张将FQ-PCR、ELISA法联合用于乙型肝炎患者，其研究结果显示，大三阳(HBsAg+HBeAg+HBcAb)组HBV-DNA阳性率及表达水平最高，分别为94.60%、(6.57±1.51)lg拷贝/毫升。本研究数据显示，HBsAg+HBeAg+HBcAb模式阳性为98.89%，HBsAg+HBeAg模式阳性率为92.31%，HBV-DNA含量为[(5.57×106)±(2.37×105)]lg拷贝/毫升，明显高于其他模式，与上述研究具有相似性，该结果说明HBsAg、HBeAg同时为阳性时，患者体内HBV-DNA复制活跃，且病毒传染性增加。分析原因在于HBeAg阳性、HBV-DNA升高是反映HBV复制最敏感指标，一旦血清中HBeAg呈阳性表达时，病毒复制活跃，血中HBV-DNA升高，且多伴有不同程度肝脏坏死、炎症、转氨酶升高现象[12-13]。同时本研究中HBsAg+HBeAb+HBcAb模式HBV-DNA阳性率为35.16%，HBV-DNA含量为[(4.14×105)±(1.54×104)]lg拷贝/毫升，低于HBsAg+HBeAg+HBcAb模式，与陈海雁等[14]研究结果具有一致性，提示乙型肝炎患者体内HBeAg已转阴，但病毒复制尚未停止，仍存在传染性，需采取相对应预防措施。同时HBsAb+HBeAb、HBeAb+HBcAb模式HBV-DNA阳性率为0%，提示HBeAg、HBsAg已转阴，HBs的产生提示患者体内HBV病毒已完全清除[15]。

综上可知，不同HBV-M模式的HBV-DNA阳性率及表达水平存在差异，故联合HBV-M定性与HBV-DNA定量检测对乙型肝炎临床诊治意义重大，值得临床推广及应用。