蓝玉簪龙胆提取物在护肤品中的应用

耿晓玲，李崇正，次旺嘎旦，谷礼民

(江阴职业技术学院 环境与材料工程系，江苏 江阴 214433)

近年来，天然植物中的活性成分被广泛地应用于食品、药品、化妆品等领域，各类植物提取成分主打的化妆品都被逐步推向了国际市场，尤其是中草药类护肤产品在市场上广受好评。我国植物资源丰富，植物成分提取方法简便易行，添加后制得的相应产品疗效显著，毒副作用小，在国内的化妆品研发领域备受关注[1-2]。

藏药“龙胆花”，藏药名“榜间”，为龙胆科龙胆属多种植物的花，主要分布于西藏、甘肃等地，常以单味或复方入药[3]。目前，国内外对蓝花龙胆的研究报道较少，现有的报道主要是针对蓝花龙胆中活性成分的分离鉴定等方面。李珊等[4]对蓝玉簪龙胆地上部分中的黄酮苷类化学成分进行了分析，得到了6个黄酮苷类化合物。杨红澎等[5]通过色谱技术进行分离，利用质谱、核磁共振等波谱技术鉴定化合物的结构，从蓝玉簪龙胆的花中分离得到5个苷类成分。刘菁菁等[6]研究发现蓝玉簪龙胆提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)均具有一定的抗菌作用，对MRSA感染小鼠也有一定治疗作用。侯颖[7]等发现蓝玉簪颗粒可增强机体抗氧化酶的活力，调节氧化，抗氧化平衡。目前，对蓝花龙胆应用于天然护肤品领域的报道还没有，本文将在蓝花龙胆提取物体外抗菌的基础上，将其应用于保湿水和润肤乳两种体系中，进行龙胆提取物的配伍性测试和抗菌测试，为蓝花龙胆开发更广阔的应用前景。

1 实验仪器与材料

1.1 主要仪器

PHS-3C型酸度计，上海大普仪器有限公司；STSJB-120电动搅拌器，郑州长城科工贸有限公司。SZF7-200粉碎机，天津市泰析特仪器有限公司；XMTD-8222真空干燥箱，国华电器有限公司；RE-52CS旋转蒸发器，上海振捷实验设备有限公司；HH-2数显恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；721分光光度计，上海现科分光仪器有限公司；VS-840/1300超净工作台，苏州长留净化科技有限公司等。

1.2 主要试剂与材料

本实验使用的氢氧化钠、硼砂、无水乙醇、透明质酸钠、聚氧乙烯(n=20)失水山梨醇硬脂酸酯、失水山梨醇单硬脂酸酯、丙二醇、甘油等均为分析纯。琼脂、蛋白胨、牛肉浸膏等均为生化试剂，以上试剂均购于北京国药集团化学试剂有限公司。

蓝花龙胆花购于西藏山南市错那县，金黄色色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉菌均为纯菌株，购于南京微生物分析检测中心。

2 实验方法

2.1 蓝花龙胆提取物的制备工艺

将蓝花龙胆进行预处理，洗净烘干粉碎，过40目筛分，得到粉末状样品。称取50g预处理后的龙胆花样品，70%乙醇作为溶剂，按照液料比6∶1(mL：g)加入装有样品的容器中，加热搅拌回流 4h后过滤。继续用相同浓度的乙醇溶液洗涤，再次过滤，合并滤液，低温离心，取上层澄清液，真空浓缩后待用。折算为干物质,将得到的浓缩物冷藏备用。

2.2 蓝花龙胆提取物抗菌特性的检测方法[8]

2.2.1 牛津杯法

供试菌株：大肠杆菌、金黄葡萄杆菌和黑曲霉菌。

用蒸馏水调整提取物的浓度，得到含量分别为1g龙胆花干品/10mL、1g龙胆花干品/5mL、1g龙胆花干品/1mL的浓缩液待用。按标准配置固体培养基，高压灭菌，制平板。将活化后的大肠杆菌、金黄葡萄杆菌稀释至浓度为1.0×10-7cfu/mL，黑曲霉菌的浓度为1.0×10-6cfu/mL，均匀涂布，将牛津杯放置于平板上。分别取200μL稀释后的提取液样品加入牛津杯中。分别做3个平行实验。将培养皿盖好放置在生化培养箱内，细菌培养温度 37.5℃，真菌培养温度 28℃。观察以上菌株生长情况及测量抑菌圈直径。

2.2.2 MIC的测定[8]

本实验采用液体稀释法测各提取物对上述菌株测定最小抑菌浓度。将各菌株接种至固体培养基上,37 ℃恒温培养24h 后, 用生理盐水将菌落洗下。用比浊管对比稀释后4 ℃储存备用。以测定抑菌圈实验中用的 1.0mg/mL 的提取液作为原液。参考文献[8]中的方法，配制相应的菌液浓度为105cfu/m L，稀释原液浓度，使最终浓度为：80.0%、70.0%、60.0%、30.0%、10.0%、5.0%。以相应的溶剂做空白对照。细菌培养条件为，37℃摇床培养 24h，真菌培养条件为28℃摇床培养 24h 后。分别取 20μL 菌液涂板培养并于 24h 后观察菌种生长情况。

2.3 保湿水基础配方

保湿水基础配方见表1～表3。

表1 保湿水基础配方A部分

表2 保湿水基础配方B部分

表3 保湿水基础配方C部分

2.4 保湿水配制工艺

将A部分水加入主锅，然后将卡波姆慢慢撒入分散均匀，然后将透明质酸钠、丙二醇预先混合搅拌后加入水相，再将部分剩下所有原料加入水相，搅拌分散均匀，加热至80-85℃。B部分待完全溶解均匀后开始降温，待温度降到50℃时，加入B01，搅拌均匀。将C部分三个组分在不锈钢容器中预先混合，搅拌至完全透明，待温度降至40～45℃时，加入主锅。加入上述全部原料后，加入一定量的蓝花龙胆提取物，余量用水补充，搅拌均匀后出料。

2.5 润肤乳基础配方

润肤乳基础配方见表4。

表4 润肤乳基础配方

2.6 润肤乳配制工艺

水相中卡波加入水中，加热搅拌至溶解完全。水相剩余料体预混合之后加入水中，加热至80℃。B相原料混合之后加热到80℃，加入水相中，均质5min。降温至60℃加入预混合的C相，之后加入龙胆提取物相原料低速搅拌。出料待用。

2.7 检测方法

保湿水的检测指标剂检测方法参见 GB/T2660。

润肤乳的检测指标剂检测方法参见 GB/T29665-2013。

2.8 抗菌物质(龙胆花提取物)与化妆品基础配方的配伍性

依据2.2.2中测得的最低抑菌浓度数据，微调后添加到保湿水和润肤乳的基础配方中， 3个月后参照标准进行观察、评价。

2.9 龙胆花提取物在化妆品体系中的抗菌性能[9]

化妆品常规防腐剂体系有水剂体系和乳霜体系。其中水剂型的配方：尼泊金甲酯 0.17%,DMDM 乙内酰尿0.2%。乳霜型的配方：尼泊金甲酯 0.2%，尼泊金丙酯 0.15%，DMDM 乙内酰尿 0.2%。

本实验按照上述体系，选用尼泊金甲酯作为阳性参照。进行抑菌圈实验，具体参考2.2.1具体方法，将牛津杯改成同直径纸片做试样。

3 实验结果

3.1 牛津杯法测定龙胆提取物抗菌特性

表5 抑菌圈直径

选取金黄色葡萄球菌(G+)、埃希氏大肠杆菌(G-)，常见肠道致病菌)、真菌黑曲霉为供试菌株，根据琼脂扩散法程度测定抑菌圈大小。在操作中，需要保证加注底层的培养基厚度均匀，否则容易出现重现性差等异常情况，主要是由于琼脂层的厚度与抑菌物质的扩散速度密切相关，因此抑菌试验的每一步都需要仔细谨慎，严格按照操作规范，才可以得到准确的检测结果。

从表5可以看出，龙胆花提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的抑菌作用，抑菌圈大小分别为 17.9mm，12.4mm。黑曲霉的抑菌圈较小，为7.1mm，抑菌效果不显著。

图1 抑菌圈直径对照图

比较各菌株对提取物敏感性的大小可以发现：金黄色葡萄球菌>大肠杆菌杆菌而龙胆花提取物对霉菌黑曲霉几乎没有抑菌作用。

3.2 MIC的确定

表6 各菌株的最小抑制浓度

注：“-”表示无菌生长；“+”表示有菌生长，“+”越多代表菌体长的越密。

测得龙胆花提物最低抑菌浓度如表6，比较各样品试管与对照试管，可以明显看出试管内肉汤培养基的浑浊度，随着提物浓度的增加，抑菌活性也增加，龙胆花提取物对各菌株的最低抑菌浓度分别为：金黄色葡萄球菌60%，大肠杆菌为70%，对黑曲霉抑制作用很小。其中金黄色葡萄球菌对提取物最为敏感。

3.3 配伍性测试结果

按照2.7、2.8中方法进行测试，90天后进行评价，结果如下：

由表7可见，添加天然抗菌物质龙胆花提取物会使化妆品颜色变化，呈现出微黄色，且随着温度的升高，颜色有所加深，但是不显著。龙胆花提取物属于水溶性物质，可以应用于水剂体系，乳液体系。 与化妆品常规体系配伍性较好，可以运用到化妆品常规体系中。

表7 龙胆花提取物与基础原料的配伍性测试

3.4 龙胆花提取物抑菌活性成分在化妆品体系中的抑菌作用

表8 抑菌成分在保湿水中的抑菌性 (抑菌圈直径单位：mm)

表9 抑菌成分在润肤霜中的抑菌性 (抑菌圈直径单位：mm)

从表8、表9可以得出以下结论：

对于本实验的两个化妆品基础体系(水，乳)，在本实验操作条件下，空白培养基对其没有抑菌作用，可以排除培养基和外界环境对抑菌效果的干扰。龙胆提取物和尼泊金甲酯阳性对照组对 2种细菌菌均有明显的抑制作用，后者对真菌也抑制效果较好，蓝花龙胆提取物几乎对黑曲霉无抑制。蓝花龙胆提取物在保湿水、润肤乳中对金黄色葡萄球菌抑菌效果较为明显，大肠杆菌次之。两种细菌在乳剂体系中的受抑制的效果要优于水剂体系，蓝花龙胆提取物在这两种不同体系产品中的抑菌圈直径最低都超过了7mm，说明提取物对这两种剂型的化妆品都有一定的抑制能力，但是与很多天然提取物一样，龙胆提取物的抑菌效果与尼泊金甲酯相比，抑菌效果要弱得多，尤其是对黑曲霉。以上结果表明，蓝花龙胆提取物可以作为防腐增效剂用于抑制化妆品中特定的微生物菌群，但是如何增强其抑菌活力，还有待进一步研究。

4 结论

随着人们生活水平的提高和对化妆品认识的加深，化妆品安全意识更加强烈。寻找更加安全有效的天然植物来源防腐剂越来越迫切。本文采用醇提法提取了西藏蓝花龙胆中的活性物质，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉为供试菌株，进行抑菌活性试验。结果表明龙胆花提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的抑菌作用，而对真菌黑曲霉的抑菌性不显著，其中金黄色葡萄球菌对提取物最为敏感。通过配制保湿水和润肤乳，进行龙胆提取物的配伍性测试和抗菌测试，发现添加天然抗菌物质龙胆花提取物会使化妆品颜色变化，呈现出微黄色，且随着温度的升高，颜色有所加深，但是不显著。龙胆花提取物可以应用于水剂体系，乳液体系， 与化妆品常规体系配伍性较好，可以运用到化妆品常规体系中。