中国木薯白点病发生调查及病原生物学特性研究

2019-06-11蔡吉苗时涛李超萍王国芬陆翠梅黄贵修

热带作物学报 2019年1期

蔡吉苗时涛李超萍王国芬陆翠梅黄贵修

摘要 2007—2018年，本課题组在对中国木薯主栽区的病害调查中发现了一种国内尚未记载的叶斑病。病害主要危害叶片，形成圆形或不规则形、常密集分布的白色至黄褐色的病斑，故命名为白点病。该病在云南、海南、广西等地区均有发生，绝大多数主栽品种和部分新育成种质均受害。经病菌分离和回接实验以及病菌形态观察、核糖体基因间隔区和β-微管蛋白基因序列分析，将该病病原鉴定为链格孢（Alternaria alternata）。病菌离体培养实验表明，菌丝生长最适条件为V9、OA、CA或CMA培养基，28 ℃，D-麦芽糖、D-山梨醇或D-乳糖，硝酸钠，光暗交替，pH 8。分生孢子萌发最适温度为28 ℃，而致死温度为60 ℃处理5 min。杀菌剂敏感性测定结果表明，在所测试的10种药剂中，10%苯醚甲环唑WG和25%吡唑醚菌酯WG的EC₅₀值分别为0.12、0.47 mg/L，对菌丝生长抑制率最高。

关键词木薯白点病;链格孢;生物学特性;杀菌剂中图分类号 S435.33 文献标识码 A

Survey， Pathogen Identification of a White Spot Disease on Cassava and Its Biological Characteristics in China

CAI Jimiao， SHI Tao， LI Chaoping， WANG Guofen， LU Cuimei， HUANG Guixiu^*

Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract During cassava disease survey from 2007 to 2018， one new leaf spot disease was found in the main cassava planting areas of China. The pathogen mainly infected the cassava leaves with densely formed round or irregular， white to tawny lesions. The disease was widely happened in Yunnan， Hainan， Guangxi and some other provinces， and most of the main cassava planting varieties and part of late breeding germplasms were also infected. The results of pathogen isolation， pathogenicity test， strain morphology observation， sequences analysis of Internal Transcribed Spacer and beta-Tubulin gene showed the disease was caused byAlternaria alternata. The pathogen in vitro cultured showed V9， OA， CA or CMA medium， 28 ℃， D-maltose， D-sorbitol or D-lactose， NaNO₃， alternative light and pH 8 were the optimum conditions for mycelial growth. The optimum temperature for conidia germination was 28 ℃ and the lethal temperature for conidia was 60 ℃ remained for 5 min. Sensitivity test confirmed 10% difenoconazole WG and 25% pyraclostrobin WG had the best mycelium inhibition effect from 10 fungicides， and the EC₅₀value was 0.12 mg/L and 0.47 mg/L， respectively.

Keywords cassava white spot disease;Alternaria alternata; biological characteristics; fungicides

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.019

木薯（Manihot esculentacrantz）为大戟科（Euphorbiaceae）木薯属灌木状多年生作物，起源于热带美洲地区，有4000多年的栽培史。1820年前后，木薯首次从东南亚传入中国广东，目前种植范围已遍及华南地区，是当地农业经济重要的组成部分。广西、海南、广东、云南、江西等地区为中国木薯主栽区，山东^[1]、河北、河南、北京、新疆^[2]等地的小范围试种也取得了成功。木薯在我国主要用作工业原料，可生产变性淀粉、化工产品、淀粉糖等大量产品^[3]。据农业部发展南亚热带作物办公室统计，2015年中国木薯种植面积约34.87万hm²，干薯总产量271.42万t^[4]。中国的木薯生产不能自给，自2005年起一直是世界上最大的进口国^[5]。2016年，中国进口木薯干片和木薯淀粉分别达到770.43和207.31万t，占世界木薯干片和木薯淀粉进口总量的60.47%和52.03%。国内木薯种植业对保障相关产业健康发展具有重要意义。

前期研究表明，目前危害我国木薯的叶部病害主要有细菌性萎蔫病、褐斑病、炭疽病^[6]、棒孢霉叶斑病^[7]、离蠕孢葉斑病^[8]和藻斑病^[9]。这些病害均有其典型症状，细菌性萎蔫病为角型病斑，褐斑病为黄褐色病斑，炭疽病发生后病叶常扭曲、干枯，棒孢霉叶斑病为中央略呈白色纸质状、边缘黑褐色而且周围有明显黄色晕圈的圆形病斑，离蠕孢叶斑病为中央有同心轮纹、边缘深褐黄色的圆形或近圆形病斑，而藻斑病为近圆形、中央灰白色毛毡状病斑且仅在生长末期发生。2007年以来，本课题组在对中国木薯病害的调查中，发现了一种和国内已报道叶部病害不同的叶斑病。病原菌主要危害叶片，侵染后形成圆形或不规则形、白色至黄褐色、常密集分布的病斑，其症状与国外记载的white leaf spot相似^[10]，因此命名为白点病。目前该病在中国木薯主栽区普遍发生，部分地点严重为害，是生产中值得关注的一个新问题。目前国外对white leaf spot仅有发生记载，其病原鉴定、防治关键技术等均为空白，因此本课题组开展了该病害的发生调查、病原鉴定、病原生物学特性及防治药剂筛选等方面研究，为相关防控工作的进一步开展提供基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 木薯品种和白点病病样木薯品种华南10号由中国热带农业科学院热带作物品种与资源研究所提供。木薯白点病病样采自海南省海口市演丰镇发病的华南10号木薯发病叶片。

1.1.2 培养基和试剂菌株培养选用V9、Czapek、PDA、CMA、CA、PSA、OA、EMA、LB等培养基，配方参见《植病研究方法》^[11]。DNA片段胶回收试剂盒和pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP和大肠杆菌JM109感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司;引物对ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TC CTCCGCTTATTGATATGC-3′^[12]，Tub2-u：5′-GA GAAAATGCGTGAGATTGT-3′ 和Tub2-d：5′-TG GTCAACCAGCTCAGCACC-3′^[13]由北京六合华大基因科技股份有限公司合成;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 杀菌剂共10种，其中可湿性粉剂（WP）共6种，水分散粒剂（WG）3种，水剂（AS）1种，其种类、浓度等见表1。

1.2方法

1.2.1 木薯白点病发生调查参考李超萍等^[6]的方法，于2007—2018年对中国木薯主要种植区进行调查。采取5点取样法，每个点选择30株植株，观察植株上的叶片发病情况，计算株发病率。

1.2.2 木薯白点病病原分离田间采集植株典型病叶，参照文献[11]的方法分离和纯化病原菌。

采用孢子液喷雾法进行病原菌致病性测定。选择地势平坦、土质疏松、土壤肥力中等的田块，采用常规方法种植木薯5个月。将病原菌在PDA平板上28 ℃光照培养7 d后，用灭菌棉签将菌落表面孢子洗下，用灭菌的3层擦镜纸滤去菌丝，将分生孢子调至1×10⁴个/mL。田间选取完全展开、健康完好的木薯叶片，进行喷雾接种，以无菌水为对照。叶片接种后用保鲜袋进行保湿处理，48 h后去掉保鲜袋，每7 d观察一次，待病害发生后，观察其症状并从发病部位重新分离病原菌，观察菌落特征以及分生孢子形状，与最初分离且接种发病的菌株做对比，确认分离物的致病性。

1.2.3 木薯白点病病原鉴定、生物学特性研究和杀菌剂筛选参照时涛等^[14]方法进行病原菌落形态、分生孢子等结构的观察和测量、ITS序列分析、生物学特性以及杀菌剂配制、室内毒力测定等方面研究。生物学特性测定中，各处理5个平板，重复3次，计算平均数和标准差，并用SAS 9.0软件进行差异显著性分析^[15]。

2结果与分析

2.1木薯白点病的发生调查

经过多年度多次调查，发现木薯白点病在海南省儋州市、海口市、文昌市、白沙县和琼中县，广西壮族自治区北海市、南宁市、桂平市、平南县，广东省遂溪县、雷州市，云南省保山市，江西省抚州市，福建省大田县以及贵州省望谟县等地区普遍发生，已经成为当地木薯种植中的常见病害（表2）。

病害通常在木薯生长中期，7月以后开始发生，随后流行为害，后期随着气温下降逐渐减轻。当前主栽的华南系列、桂熱系列、南植系列等绝大多数主栽品种以及新育成的H1071、JG1301等种质均受害。在病害流行高峰期，云南保山地区的华南205、桂热4号，广西武鸣地区的H1071、桂热4号和南植199，海南海口和文昌地区的华南10号等品种（或种质）的株发病率均在70%以上。

田间条件下，病原菌主要危害叶片，通常中下部叶片最先受害，随后向上扩展。叶片受侵染后，形成近圆形或不规则形的病斑。病斑最初为白色，后期黄褐色，直径1.5～7.0 mm，其边缘下陷，厚度约为正常叶片的一半（图1）。病斑背面边缘通常为褐色，周围有黄色晕圈，田间湿度大时可见灰白色点状物，为病原菌子实体。病斑在叶片上常成片密集分布，生长后期偶有单独分布。

发病叶片随后变黄，提前脱落。不同品种之间病斑的大小、颜色、落叶情况等略有差异。病害严重发生时，中下部叶片大量脱落，严重影响木薯的长势和产量。

调查中发现，华南10号和H1071受害尤为严重，植株受侵染后，中部和下部绝大部分叶片上出现大量密集分布的白色至黄褐色的典型病斑。2015年广西武鸣地区的H1071和2017、2018年海南文昌的华南10号植株受害后发病叶片大量脱落。

2.2木薯白点病病原菌的分离和致病性鉴定

2016年10月，在海南省海口市演丰镇受害木薯华南10号植株上采集白点病病样，病原菌分离并经单孢纯化后，编号为CAAHN01。2017年8月，在种植5个月的华南10号木薯植株上，采用孢子液喷雾法对中下部叶片进行接种，14 d后接种叶片上形成密集分布、和田间症状类似的白色至黄褐色小病斑，而接种无菌水的对照叶片无任何症状（图2）。从接种后病斑上重新分离获得了培养性状和分生孢子形态与最初分离物一致的分离物，表明该菌株为该病的致病菌。

2.3木薯白点病病原菌的鉴定

2.3.1 CAAHN01的形态观察在PDA平板上，CAAHN01菌落为圆形，边缘整齐，中间灰色，边缘白色，气生菌丝和基内发达（图3）。菌丝分隔，多分枝。分生孢子梗为单生或簇生，直或弯曲。短喙柱状，淡褐色。分生孢子大小为27.2～ 40.0 μm×8.1～12.8 μm，单生或短链生，倒棍棒状或倒梨形，浅褐色或褐色，具有3～7个横隔膜和1～3个纵、斜隔膜，多数为3～5个横隔膜，分隔处略隘缩（图4）。根据上述形态特征，参考张天宇^[16]的描述，初步鉴定该病原菌为链孢霉目（Moniliales）黑霉科（Dematiaceae）链格孢属（Alternaria）的链格孢（Alternaria alternata）。

Tub2-u和Tub2-d引物对进行PCR扩增，均获得大小约0.6 kb的目的片段。扩增产物用ITS1和Tub2-d引物进行测序后，分别获得566和533 nt，序列已提交NCBI数据库，登录号为MH572535和MH572536。序列比对结果表明，MH572535与分离自受污染木制雕塑的链格孢菌株Su-VIII-1序列（MF475920）完全一致^[17]，与侵染黑色苦莓的链格孢菌分离物15-322（LC131450）和15-246（LC131446）、侵染葡萄的菌株HMY 2-1（KJ739880）的序列同源性为99%，而MH572536和侵染紫花苜蓿的链格孢菌株MP23（KJ396336）和MP39（KJ396337）、侵染枇杷的链格孢菌株PAK38（KY126829）、侵染茶树的菌株CS36-5（KY814630）和CS36-3（KY814628）（未发表资料）的同源性为99%，进一步从分子水平证明其为链格孢。

2.4菌株CAAHN01的生物学特性测定

菌株培养结果表明，菌株CAAHN01在V9、Czapek、CMA、PDA、CA、PSA、OA、LB和EMA等培养基上均能生长，其中V9、OA、CA和CMA上生长速度最快（图5A）。在分别添加不同的8种碳源或6种氮源的Czapek培养基平板上，CAAHN01均能生长，其中以D-麦芽糖、D-山梨醇、D-乳糖为碳源以及以硝酸钠为氮源的条件下生长最快（图5B，图5C）。在PDA培养基平板上，菌株在4～37 ℃均能生长，但28 ℃生长速度最快（图5D）;光暗交替和pH 8条件下，菌落生长速度最快（图5E，图5F）。分生孢子在10～40 ℃均能萌发，28 ℃时萌发率最高（图6A），致死温度为60 ℃处理5 min（图6B）。

2.5室内杀菌剂筛选

10种杀菌剂的各处理浓度对数与生长抑制率几率值之间呈线性相关，其浓度对数-抑制率几率值的毒力回归方程、相关系数、和EC₅₀等见表3。从表3中可以看出，10%苯醚甲环唑WG和25%吡唑醚菌酯WG抑菌效果优于其他杀菌剂，EC₅₀≤0.47 mg/L，其中10%苯醚甲环唑WG的EC₅₀最小。50%异菌脲WP和14%咪鲜胺锰盐WP的EC₅₀≤2.04 mg/L，优于其他6种杀菌剂。2%春雷霉素AS的EC₅₀为11.41 mg/L，优于其他4种。80%代森锰锌WP和80%烯酰吗啉WG的EC₅₀≥48.87 mg/L，效果仅优于75%百菌清WP、50%多菌灵WP和70%甲基托布津WP，而这2种杀菌剂的EC₅₀≥2276.38 mg/L。10种杀菌剂的抑菌效果排序为：10%苯醚甲环唑WG（三唑衍生物类）>25%吡唑醚菌酯WG（甲氧基丙烯酸酯类）>50%异菌脲WP（二甲酰亚胺类）>14%咪鲜胺锰盐WP（咪唑类）>2%春雷霉素AS（农用抗生素类）>80%代森锰锌WP（取代苯类）>80%烯酰吗啉（吗啉类）WG>75%百菌清WP（取代苯类）>50%多菌灵WP（苯并咪唑衍生物类）>70%甲基托布津 WP（取代苯类）。

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