爱德华菌免疫刺激下牙鲆相关基因的表达分析

摘要：通过腹腔注射爱德华菌人工感染牙鲆，观察不同时间段内MyD88基因、IL-1基因及TNF基因表达的情况，并利用实时荧光定量PCR对这些基因进行定量和定性分析。结果表明三基因均参与了牙鲆人工感染爱德华菌后的免疫反应。

关键词：牙鲆;爱德华菌;MyD-88基因;IL-1基因;TNF基因;实时荧光定量PCR

1绪论

目前，对于牙鲆患细菌性疾病——爱德华菌病的控制传统方法是采用抗生素类药物。但此方法虽可部分治疗爱德华菌病并限制其蔓延，但易造成抗生素类等药物的积累，使生态环境遭到破坏，打破平衡。因此寻找并开发合适的鱼类疾病免疫技术日渐重要。目前，研究鱼类免疫系统可为研究育苗、育种，提高鱼类的免疫力、促进渔业快速发展提供重要依据。[1]

2方法

2.1爱德华菌培养

将爱德华菌接种到配制的营养培养基上面进行37℃恒温震荡培养15小时。

2.2腹腔注射活菌的免疫反应

将培养所得的菌悬液注射到牙鲆鱼的腹腔进行免疫。然后将人工感染的牙鲆鱼单独放在循环水族箱中培养，并在之后的0d-7d的每天同一时间取鱼的头肾组织器官进行后续实验。

2.3RNA抽提

采用QIAGE公司试剂盒进行总RNA的提取。得到样品后，采用紫外分光光度计进行RNA纯度的鉴定。纯度鉴定主要是根据在两个不同波长下的光吸收值的比值大小来决定，即OD260OD280的比值。[2]

2.4cDNA第一链的合成

根据QIAGE试剂盒说明书进行相关操作。

2.5实时荧光定量PCR检测

3结果

3.1总RNA检测

根据结果计算，RNA的OD260OD280在1.80-2.05之间，说明本次试验提取的RNA的质量很高。

3.2MyD-88、IL-1和TNF三基因相对表达量计算

时间0d1d2d3d4d5d6d

MyD-8810.410.540.730.141.890.69

IL-110.460.750.330.170.341.72

TNF1290.02503.2546.8531.78582.05119.02

按照生物统计学标准误差原理计算（P<0.05，n=3），并观察得到如下结果：

①MyD-88基因的表达量在0d至1d慢慢下降，1d至3d缓慢上升，3d至4d急速下降，4d时达最低值，4d至5d急速上升，5d时达到最大值，5d至7d缓慢下降。

②TNF基因的表达产物在0d至1d时缓慢下降，1d至2d缓慢上升，2d至4d急速下降，4d时达最低值，4d至6d急速上升，6d时达到最大值，6d至7d缓慢下降。

③IL-1基因的表达产物在0d至3d缓慢上升，3d至4d则急速下降，至最低值，4d至5d则急速上升，在5d时达到最大值，后5d至6d缓慢上升，同样在最后一天再次慢慢回降。

3.3实时荧光定量PCR

根据实时荧光定量PCR的方法检测结果可知，RT-PCR产物的Tm值（基因表达水平）在79至86范围内，且82至84之间居多，故产物不是引物二聚体。

4结论

通过本实验结果，溶解曲线及CT值的分析，可见MyD-88、TNF、IL-1三基因均参与了免疫反应。牙鲆在感染爱德华菌后随着时间的推移，基因表达的产物量也随之有所变化，具体表现为在不同的时间内变化的大小不同。该结论为寻找和开发疗牙鲆疾病免疫新技术提供一定的可行性。

5讨论

硬骨鱼类虽然属于最原始的一种脊椎动物，但他们的免疫系统却和哺乳动物相似，同样具有天然性免疫和适应性免疫。[3]当机体外层防御因感染而被破坏时，将会出现天然免疫，此过程伴随着一系列受细胞因子影响的细胞和介质的参与变化。然而Toll受体又是天然免疫系统中一个重要的通路，故研究Toll受体信号通路及免疫过程中相关细胞因子的变化，进而可加深对天然免疫过程的了解。

牙鲆是我国近岸海水养殖的重要经济鱼类之一，但由于高密度集约化养殖，鱼类疾病对此影响日趋严重。爱德华菌病是影响鱼类健康的致病菌之一，我们通过了解鱼类免疫系统及相关过程中细胞因子的變化，可更早的找到适合的方法改善这一问题。也可进一步保护我们的生态环境，为开发鱼类免疫药物提供理论依据。

参考文献：

[1]唐玫，马广智，徐军.2002鱼类免疫学研究进展[J].免疫学杂志，2002，18（3）：113-116.

[2]吴恋，孙金生，耿绪云，潘宝平，魏俊利，王雪慧，高虹.牙鲆Toll样受体1基因全长cDNA的克隆及特征分析[J].安徽农业科学，2012.40（26）：12754-12755.

[3]邱丽华，张汉华，吴进锋.鱼类肿瘤因子基因和手提的研究进展[J].中国水产科学，2004，9，11（5）：482-287.

作者简介：孙亚婷（1990-），女，汉族，天津武清人，研究方向：免疫。