红皮云杉球果多酚类含量及抗氧化活性与海拔的相关性研究

康宁 李德海 王銮 龚金华

摘 要：【目的】研究伊春地區红皮云杉（Picea koraiensis Nakai）球果的多酚、原花青素、黄酮含量及其抗氧化能力受海拔的影响，为红皮云杉的繁殖培育以及开发利用提供理论依据。【方法】以长白山南北坡120、 520、920 m的红皮云杉球果为研究对象，分别测定其多酚、原花青素、黄酮含量及其抗氧化性指标，即总还原力和DPPH·自由基清除能力，采用SPSS21.0等对海拔与球果多酚类成分含量及抗氧化功能间的影响差异进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和相关分析（Correlation Analysis）。【结果】随着海拔高度增加，球果多酚、原花青素及黄酮含量均表现为920 m>520 m>120 m。其中红皮云杉球果中多酚与海拔呈极显著相关性（P<0.01），原花青素与海拔呈显著相关性（P<0.05），黄酮与海拔则无相关性（P>0.05）;球果提取物的总还原力及DPPH·自由基清除能力也随海拔增高而增加，其中总还原力与海拔呈显著相关性（P<0.05），而DPPH·自由基清除能力与海拔无显著的相关关系（P>0.05）。【结论】伊春地区红皮云杉球果中多酚、原花青素及黄酮含量随海拔的升高而显著升高，海拔是红皮云杉球果中三种活性成分含量及抗氧化能力的重要影响因子，其主要原因为温度的变化及太阳光光谱的差异，海拔越高温度越低且高处紫外线-B较强，进而促进了次级代谢产物的积累。

关键词：红皮云杉球果;海拔;有效成分;抗氧化

中图分类号：S791.182文献标识码：A文章编号：1006-8023（2019）01-0016-06

Abstract： [Objective] The objective of this paper was to study the effect of altitude on the contents and antioxidant capacity of polyphenols， proanthocyanidins， and flavonoids extracted from Picea koraiensis pine cones on Changbai Mountain in Yichun， and to provide theoretical basis for breeding， development and utilization of Picea koraiensis.[Method] The antioxidative indexes （i.e. total reducing capacity and DPPH· scavenging ability） and the contents of polyphenols， proanthocyanidins， and flavonoids in Picea koraiensis pine cones at different altitude （120 m， 520 m， and 920 m） that collected from the northern and the southern slopes of Changbai Mountain were determined. Particularly， the one-way ANOVA and correlation analysis were conducted by SPSS 21.0 to explore the effect of altitude on flavonoids contents and antioxidant capacity. [Results] The results showed that the contents （920 m > 520 m > 120 m） of polyphenols， proanthocyanidins， and flavonoids increased with the increase of altitude. Specifically， the correction between polyphenol content and the altitude was highly significant （P < 0.01）， and that between proanthocyanidins content and the altitude was significant （P < 0.05）， while there was no correction between flavonoids content and the altitude （P > 0.05）. In terms of total reducing capacity and DPPH· scavenging ability， they also increased with altitude， in which the total reducing capacity was significantly correlated with the altitude （P < 0.5）， while the DPPH· scavenging ability was not （P > 0.05）. [Conclusion] The contents of polyphenols， proanthocyanidins and flavonoids in Picea koraiensis cones that collected in Yichun were significantly increased with the altitude increasing， this result indicated that the altitude was the dominated factor that affected the contents of these three bioactive compounds. And we can speculate that the differences in contents were resulted from the temperature change and sunlight spectrum at different altitude levels. More precisely， the higher the altitude is， the lower the temperature is， and the higher the UV-B is， and consequently， more secondary metabolites are produced.

Keywords： Picea koraiensis Nakai cones; altitude; bioactive constituents; antioxidant

0 引言

植物生长过程中环境因素是导致植物生长及内部代谢的直接原因，主要是通过改变温度、湿度和土壤类型等外部环境条件，引起植物与环境的生态关系发生变化，最终导致植物中代谢成分种类、含量及其生理功能的不同[1]。其中海拔对植物本身的代谢应答影响非常显著，海拔由低至高气温递减，相对湿度递增，光照渐强，紫外线增加，导致次级代谢产物含量增加，植物也会由于氧化应激反应而改变代谢应答，进而改变活性成分含量及相关功能性能。目前国內外有一些关于海拔对植物代谢产物含量及功能的影响已有报道，研究发现海拔对桃儿七（Podophyllum hexandrum）中可溶性糖、黄酮及酚类及其抗氧化功能具有显著影响，并且通常呈负相关[2];Senica等发现黑莓浆果及花中酚类的含量随海拔的升高而增加[3]。

红皮云杉是东北的主要造林和绿化树种，又是良好的造纸原料[4]。主要分布于黑龙江、吉林两省中的小兴安岭、完达山、张广才岭及长白山林区。目前对红皮云杉的主要研究有其种群更新及遗传多样性[5-6]，球果有效成分的提取、稳定性及其抗氧化性研究[7-9]。关于海拔与球果的有效成分及其抗氧化性的关系还未见报道。本研究以伊春地区的三个不同海拔下生长的红皮云杉为实验对象，测定球果中多酚、黄酮、原花青素含量及其抗氧化功能，分析其与海拔之间的相关性，旨在揭示不同海拔的生长环境对红皮云杉球果成分及功能的指导意义。

1    材料与方法

1.1    材料

本试验地伊春，取样时间为2017年9月，在120 ± 2 m、520 ± 2 m、920 ± 2 m海拔位置分别按南北两个坡向各随机采集10个球果样本，共计60个样本。将取得样本经室温自然阴干，除去中间的木质轴，粉碎过40目筛即得红皮云杉果粉。称取一定质量的红皮云杉球果粉于三角瓶中，以1：25的比例加入60%的乙醇溶液，60 ℃水浴加热3 h后，采用真空泵双层滤纸抽滤，得到红皮云杉球果活性成分提取液，经旋转蒸发并冷冻干燥，待用。

1.2    红皮云杉球果酚类成分的测定

1.2.1    多酚含量的测定

采用福林酚法测定多酚含量，参照中华人民共和国国家标准GB/T 8313-2008。

测得回归曲线方程为：

1.2.2    原花青素含量的测定

选用香草醛—浓盐酸法测量原花青素含量[10]。

测得回归曲线方程为：

1.2.3    黄酮含量的测定

采用硝酸铝法对黄酮含量进行测定[11]。

1.3    抗氧化功能的测定

1.3.1    总还原力的测定

根据Yan Zhao 等[12]研究的方法，稍作修改，取样液1.0 ml，依次加入0.2 mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液和1%的K3Fe（CN）6溶液各2.5 ml，混合均匀，混合液置50 ℃保温20 min，放至室温，加入2.5 ml 10%三氯乙酸，混合均匀，静止10 min，取混合液2.5 ml，加2.5 ml 蒸馏水和0.5 ml 0.1%的FeCl3，混合均匀，放置10 min，在700 nm 处测定吸光度，以蒸馏水为空白对照。

1.3.2    DPPH·自由基清除能力的测定

准确称取DPPH粉末0.006 g，用无水乙醇溶解于100 mL容量瓶中，浓度为0.06 mg/mL。吸取1 ml样液于试管中，依次加入3.00 mLDPPH溶液，混合均匀室温下避光放置30 min，后于517 nm波长处测定吸光值A1;同法操作，用同体积蒸馏水代替稀释样液，测定吸光值A0;不加DPPH用等体积无水乙醇代替，加入样液，同法操作，测定吸光值A2[13]。

1.4    数据处理

所有分析均有三组平行试验，数据初步计算采用Excel，描述统计（Descriptive Statistics），单因素方差分析（One-way ANOVA）和相关分析（Correlation Analysis）采用 SPSS 21.0。

2    结果与分析

2.1    海拔对红皮云杉球果酚类物质含量影响

不同海拔条件下伊春地区红皮云杉球果多酚、原花青素及黄酮含量的变化情况、单因素方差分析见表1和表2。

采用以上方法对三个不同海拔下球果中的多酚、原花青素及黄酮含量进行测定，发现920 m海拔下的三种成分含量最高，其次为520 m，120 m海拔下的含量最低（表1）。其中在920 m海拔下球果的多酚含量高达98.79 mg/g，平均值达97.86 mg/g，在920 m和520 m海拔下分别较低一级海拔增加了16.54%、21.26%，高海拔（920m）与低海拔（120 m）相比，球果中多酚含量增加了41.31%;球果中原花青素含量在海拔920 m处平均值可达82.05 mg/g，在海拔920 m和520 m下分别较低一级海拔增加了6.82%、12.96%，高海拔与低海拔相比，球果中原花青素含量增加了20.66%;球果中黄酮含量在海拔920 m处最高可采用以上方法对三个不同海拔下球果中的多酚、原花青素及黄酮含量进行测定，发现920 m海拔下的三种成分含量最高，其次为520 m，120 m海拔下的含量（表1）。其中在920 m海拔下球果的多酚含量高达98.79 mg/g，平均值达97.86 mg/g，在920 m和520 m海拔下分别较低一级海拔增加了16.54%、21.26%，高海拔（920 m）与低海拔（120m）相比，球果中多酚含量增加了41.31%;球果中原花青素含量在海拔920 m处平均值可达82.05 mg/g，在海拔920 m和520 m下分别较低一级海拔增加了6.82%、12.96%，高海拔与低海拔相比，球果中原花青素含量增加了20.66%;球果中黄酮含量在海拔920 m处最高可达73.74 mg/g，平均值为68.68 mg/g，在920 m和520 m下分别较低一级海拔增加了10.18%、4.86%，高海拔与低海拔相比，球果中黄酮含量增加了16.37%。通过变异分析可知，920 m下的三种活性成分的变异系数最小，即海拔越高，个体间差异越小，成分含量趋于稳定。从方差分析结果看来（表2），伊春地区海拔对多酚及原花青素的提升效应是显著的（P<0.05），其中海拔对球果中多酚含量的增加成极显著（P < 0.01）。

2.2    海拔对红皮云杉球果抗氧化能力影响

不同海拔条件下伊春地区红皮云杉球果多酚总还原力和DPPH·自由基清除能力的变异情况、单因素方差见表3和4。

测定三个不同海拔生长条件下红皮云杉的总还原力及DPPH·自由基清除能力，结果表明，不同海拔下的球果抗氧化能力存在差异（表3）。其中总还原力的最大值出现在最高海拔（920 m）中，达到0.591%，高海拔地区（920 m）的球果提取物的总还原力平均值为0.591%，在海拔920 m和520 m下，总还原力分别较低一级海拔下增加了8.64%、3.23%，高海拔（920 m）与低海拔（120 m）相比，总还原力增加了12.14%。通过单因素方差分析（表4）可知海拔与总还原力之间存在显著差异（P<0.05）。

红皮云杉球果提取物的DPPH·自由基清除能力的峰值也出现在高海拔地区，为85.83%，高海拔地区（920 m）的平均值达到83.31%。在海拔920 m和520 m下，DPPH·自由基清除能力分别较低一级海拔下增加了3.00%、0.823%，高海拔（920 m）与低海拔（120 m）相比，DPPH·自由基清除能力增加了3.85%。单因素方差分析结果表明海拔与球果提取物的DPPH·自由基清除能力无显著差异（P > 0.05）。表3中可以看出它们的变异系数均不大，说明不同个体间的土壤养分、微生物种群和种龄等细微差别对球果抗氧化能力影响甚微。

2.3    酚类含量与抗氧化能力间的相关性分析

相关分析表明（表5），海拔与多酚、原花青素、黄酮及总还原力、DPPH·自由基清除能力均呈正相关关系，其中海拔与原花青素、总还原力呈显著正相关，相关系数分别为0.922（P<0.05）和0.730（P<0.05）;与多酚呈极显著正相关，相关系数为0.734（P <0.01）;多酚与总还原力之间也存在显著的相关关系，相关系数为0.739（P<0.05）。但黄酮含量与海拔、多酚、原花青素含量之间都存在很弱的正相关关系，相关系数分别只有0.483（P> 0.05）、0.427（P > 0.05）和0.370（P > 0.05）。

3 结论与讨论

从研究结果中可以看出，红皮云杉球果提取物中的多酚、原花青素及黄酮含量随海拔的变化呈现极显著差异。罗文文[14]、蒋宝[15]和Kaur 等[16]的研究结果同样表明不同海拔地区的同一物种中主要成分具有显著差异。海拔的变化直接导致植物生长环境的温度和光照等条件发生改变，刘金福[17]研究发现海拔导致的突然降低或升高温度均可刺激苦荞中黄酮类次级代谢产物的合成;李国良等[18]报道低温可诱导花青素合成相关基因的表达，使花青素含量升高。本研究中高海拔地区球果中多酚、原花青素及黄酮含量均显著高于低海拔地區，其原因可能是伊春高海拔地区早晚温差大及平均气温低刺激植物次级代谢产物的合成，导致红皮云杉球果中多酚、原花青素及黄酮含量含量增加。抗氧化功能分析表明不同海拔对红皮云杉球果提取物总还原力及DPPH·自由基清除能力的影响也表现为920 m>520 m>120 m。

当海拔升高时，环境条件渐趋恶劣，对植物造成的氧化胁迫增强，但植物保护系统的功能亦相应加强，从而增强了其抵抗逆境胁迫的能力，即提高了其抗氧化性[19-20]。也有研究表明太阳紫外线B（UV-B）辐射沿海拔升高而增强，是由于高空空气稀薄，UV-B辐射强度一般随地表海拔高度的升高而增加[21]，UV-B辐射是太阳辐射光谱中能部分到达地表，且对地球上的生物构成伤害的一段电磁光谱[22]，它与植物的生长有着密切的联系，吴杏春[23]等人研究表明，植物抗逆性与生物膜结构功能关系密切，UV-B辐射使植物细胞质膜的透性发生变化，其主要原因：一是改变植物细胞质膜的酶系统，二是改变植物质膜的结构物质。因此伊春海拔地区强UV-B 辐射也可能导致红皮云杉球果成分抗氧化性增强。此外，Lors [24]等人研究了德国巴伐利亚州的云杉，发现在臭氧环境存在下，UV-B辐射会引起云杉总SOD活性的增加。海拔的升高不仅导致了温度、紫外线等的变化，也会改变土壤中微生物的丰富度及均匀度[25-28]，进一步影响植物中成分含量及功能特性的表达。

本研究中伊春红皮云杉球果中多酚、原花青素及黄酮含量随海拔的升高而显著升高，这主要归功于温度的变化、太阳光光谱的差异及土壤微生物的不同，海拔越高温度越低，且高处紫外线-B较强、微生物种群丰富进而促进了次级代谢产物的积累。球果的抗氧化性与海拔呈正相关关系。本研究结果与大多相关研究结果一致，但结果中不相关的因素不能直接排除，存在样本间差距，还需进一步在实验室中进行具体研究，对CO2浓度、湿度和光合作用等细微条件进行把控，以有效成分含量及抗氧化性为最终目标，进一步确定红皮云杉的最适生长条件，为红皮云杉种植地的选取及合理利用其价值奠定基础。

【参 考 文 献】

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