中国兰花苞基因组DNA的提取及优化

林成立

(福建省林业科技试验中心，福建 南靖 363600)

DNA是生物遗传信息的载体和主要的遗传物质。随着分子生物学在花卉研究中的广泛应用，花卉的基因组测序、分子辅助育种、遗传工程等研究不断深入[1-3]。目前已有许多物种的DNA提取方法被开发并成功应用，如菊花[4]、大花蕙兰[5]、茉莉花[6]、梅花[7]、红掌[8]、猕猴桃[9]等植物的DNA提取方法已见报道。高质量的基因组DNA是进行分子生物学研究的基础，但不同生物学材料的物质组成及含量不同，使得DNA的提取方法不同。去除多糖、多酚等杂质是提取高质量DNA的主要难题。多糖、多酚易与DNA形成难溶复合物，且多酚氧化后会形成不可逆褐色产物，干扰DNA的絮状结构，导致提取质量不佳。目前，已有许多学者提出了去除多糖、多酚等杂质的解决办法。闫玖英等[10]采用细胞裂解前加入干扰物清洗液，提高β-巯基乙醇和PVP浓度抑制多酚氧化，沉淀DNA时加入1/10体积3 mol·L-1NaAC，可有效去除果实中多糖和多酚等物质；谢志亮等[11]在异丙醇沉淀DNA前加入5 mol·L-1NaCl可有效去除多糖；张妙彬等[12]通过细胞裂解前加入清洗液获得石斛基因组DNA；李建光等[13]利用多糖高盐溶解原理成功获得蛇皮果高质量的基因组DNA。

国兰是原产于中国的兰属(Cymbidium)地生兰类植物，其叶片DNA提取方法已见报道[14]。但采摘兰花叶片对植株生长影响较大，尤其是部分稀有或名贵品种，而采摘花苞对植株生长的影响较小，可作为国兰基因组DNA提取的首选材料。目前有关国兰花苞DNA提取的研究鲜见报道。因此，本文以墨兰‘企黑’为试材，在常规CTAB提取法的基础上进行改良，探索国兰花苞高质量基因组DNA的提取方法，以期为国兰全基因DNA获取提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

墨兰‘企黑’采自福建省林业科技试验中心兰花种质资源圃。采摘新鲜花苞，液氮速冻，于-80 ℃冰箱保存，备用。洗净液：0.4 mol·L-1葡萄糖+3%可溶性PVP+10 mmol·L-1β-巯基乙醇；常规CTAB法裂解缓冲液：100 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)+20 mmol·L-1EDTA(pH8.0)+0.5 mol·L-1NaCl+1.5%SDS+10 mL·L-1β-巯基乙醇(现用现加)；改良CTAB法裂解缓冲液：100 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)+20 mmol·L-1EDTA(pH8.0)+0.5 mol·L-1NaCl+1.5%SDS；体积比为24∶1的氯仿/异戊醇；5 mol·L-1NaCl溶液；TE缓冲液：10 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)+1 mmol·L-1EDTA(pH8.0)。

1.2 DNA提取方法

1.2.1 常规的CTAB提取法 称取0.1 g花苞，用液氮充分研磨成粉末，快速转移至1.5 mL离心管。用移液枪加入600 μL经70 ℃预热的DNA裂解缓冲液，充分混匀，放入70 ℃水浴锅水浴30 min，每隔5 min上下颠倒离心管，使细胞充分裂解。水浴后加入600 μL氯仿/异戊醇溶液，混匀，静置10 min后以12 000 r·min-1离心10 min。取上清液至1.5 mL离心管并加入等体积异丙醇，混匀后可见絮状物，静置5 min，4 ℃下10 000 r·min-1离心5 min。弃上清液，加入200 μL 75%酒精清洗沉淀，4 ℃下3 000 r·min-1离心1 min(重复1次)，充分晾干后溶解于TE缓冲溶液中，于-40 ℃冰箱保存，备用。

1.2.2 改良的CTAB提取法 称取0.1 g花苞，用液氮充分研磨成粉末，加入1 mL 洗净液继续研磨至糊状后转移至1.5 mL离心管中，常温下以13 000 r·min-1离心10 min。用移液枪将胶状物迅速吸出(底部沉淀与上清液间)，加入600 μL裂解缓冲液和150 μL无水乙醇，充分混匀后于70 ℃水浴锅水浴30 min，每隔5 min上下颠倒混匀。水浴后加入600 μL氯仿/异戊醇溶液，静置10 min，常温下以13 000 r·min-1离心10 min。取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇溶液，静置10 min，常温下以13 000 r·min-1离心10 min。取上清液并转移至新的1.5 mL离心管中，加入等体积异丙醇和1/2体积5 mol·L-1NaCl溶液(进一步去除多糖和多酚类物质[13])，混匀，常温下静置5 min。4 ℃下10 000 r·min-1离心5 min。弃上清液，加入200 μL 75%酒精清洗沉淀，4 ℃下3 000 r·min-1离心1 min(重复1次)，充分晾干后溶解于TE缓冲溶液中，于-40 ℃冰箱保存，备用。

1.3 DNA质量检测

取3 μL DNA提取物与2 μL Loading buffer混匀，在1%琼脂糖凝胶中电泳30 min(电泳仪型号：BIO-RAD PowerPac Universal；电泳缓冲液：1×TAE；电泳电压：150 V)。使用电泳凝胶成像系统(型号：BIO-RAD Gel DOCTMXR+)检测DNA的完整性。使用超微量核酸测定仪(型号：Thermo NANODROP ONE)测定DNA的提取浓度、D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm。

1.4 PCR扩增

选择ISSR分子标记引物UBC842为引物，对DNA提取物进行PCR扩增检验(PCR仪型号：BIO-RAD T100TM)。20 μL反应体系为：60 ng DNA模板，0.25 μL引物(10 mmol·L-1,北京六合华大基因科技有限公司)，10 μL 2×Taq PCR SuperMix预混酶(北京全式金生物技术有限公司)，无菌水补足至20 μL； PCR程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 变性45 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，45个循环，72 ℃充分延伸5 min，4 ℃待机保存。

2 结果与分析

2.1 墨兰‘企黑’花苞基因组DNA提取浓度及质量检测

A.常规CTAB法；B.改良CTAB法。图1 DNA提取物电泳图Figure 1 Electropherograms of extracted DNA

墨兰‘企黑’花苞基因组DNA电泳图见图1，其提取物质量检测结果见表1。采用常规CTAB法提取‘企黑’花苞DNA，发现大部分DNA抱团滞留在样孔中(图1A)；DNA提取物浓度高达1 837.5～2 024.5 ng·μL-1，但3个试样DNA提取物的D260 nm/D280 nm均<1.5，D260 nm/D230 nm均<0.8(表1)，表明DNA可能被蛋白质、多糖、多酚等杂质污染，提取物粘稠，甚至胶状抱团。采用改良的CTAB法提取‘企黑’花苞DNA，其电泳图(图1B)显示DNA条带清晰、无拖带、无RNA污染；D260 nm/D280 nm介于1.78～1.81之间，D260 nm/D230 nm介于1.99～2.12之间，DNA浓度为216.5～245.8 ng·μL-1(表1)，说明改良CTAB法提取的DNA浓度低于常规方法。这主要由于纯化步骤造成一部分DNA损失，但改良后的提取浓度足以满足大部分分子生物学实验要求[5，13-14]。

表1 DNA提取产物质量检测Table 1 Quality testing of extracted DNA

1)编号对应图1电泳图泳道。

2.2 PCR扩增检验

图2 PCR扩增检验电泳图Figure 2 Electropherograms of amplified PCR products

PCR扩增是大多数分子标记、基因克隆等分子生物学研究的技术基础，DNA提取物质量合格与否直接影响PCR扩增的成败。为进一步检验改良CTAB法提取的‘企黑’花苞基因组DNA质量，采用ISSR分子标记引物UBC842进行PCR扩增检验(图2)。由图2可知，PCR扩增条带清晰、无拖带，表明采用该方法提取的DNA质量合格，可以作为后续分子标记、基因克隆等分子生物学研究的PCR扩增模板。

3 讨论

国兰花苞富含多糖、多酚等次生代谢物质，提取过程中易出现抱团成胶、提取产物粘稠、电泳时DNA滞留在样孔中等问题。本研究采用常规CTAB法提取墨兰‘企黑’DNA，发现使用异丙醇沉淀核酸后出现沉淀抱团成胶、无法溶解的现象，这主要是由于花苞中可能含有易包裹DNA的多糖物质，使得DNA难以溶解。且提取过程中，多酚类物质与不可逆氧化成醌类物质发生褐变，而与DNA结合成不可逆复合物，导致DNA纯度下降。为了解决上述问题，本研究利用活细胞中细胞区室化，多糖、多酚及其他杂质与DNA相互隔离的原理[15]，在裂解细胞核前加入洗净液以除去细胞质中大部分组分，发现改良后的CTAB法可有效防止多酚类物质被氧化，提取到高质量的国兰花苞基因组DNA。

多糖与DNA具有相似的理化性质，易与DNA一起沉淀，影响DNA的提取。但除去多糖的同时也容易带走DNA，从而降低提取率。CTAB提取法是一种低成本、低毒、操作简单的DNA提取方法，针对不同材料进行一定程度的优化均能取得不错的效果[9]。本研究表明，仅在细胞裂解前加入洗净液，提取产物依然存在一定程度的粘稠及拖带现象。低浓度乙醇(10%～30%)可以沉淀多糖[16-17]及在沉淀DNA的同时加入1/2体积NaCl(5 mol·L-1)能有效去除多糖[18]。本研究在裂解细胞核离心后，加入1/4体积的无水乙醇，以沉淀上清液中的多糖，并在沉淀DNA的同时加入1/2体积NaCl(5 mol·L-1)以充分去除多糖。该方法可以有效提取高质量的国兰花苞基因组DNA。