感染日本血吸虫前后东方田鼠血清补体的动态变化和杀虫作用

柴淑梅，张 倩，翟 颀，余新刚，洪 炀，陆 珂，李 浩，林矫矫，谢建芸，傅志强

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241；2. 上海实验动物研究中心，上海 201203）

日本血吸虫病是我国长江中下游及以南地区流行的危害严重的人畜共患寄生虫病，其病原为日本血吸虫，可寄生于7属41种哺乳动物，不同种类的宿主对日本血吸虫感染的适宜性不同[1]。东方田鼠（Microtus fortis）是迄今为止发现的唯一一种具有天然抗日本血吸虫病特性的哺乳动物。日本血吸虫在东方田鼠体内先后经历皮肤期童虫、肺期童虫及肝期童虫的发育过程，最终在肝脏消亡[2]。多位学者从血清、组织蛋白质组学和差异基因等不同方面研究了东方田鼠与其他宿主之间差异[3-7]。然而，东方田鼠天然抗日本血吸虫机制仍然未被阐明，血吸虫移行过程中东方田鼠的免疫应答一直是学者们关注的焦点。

补体是宿主先天性免疫的重要组成部分，同时也参与适应性免疫应答[8]。补体在宿主抗寄生虫感染免疫应答中具有重要功能。Boyle等[9]对具有疟疾抗性人群的免疫力进行分析，结果表明补体具有重要作用，抗体和补体可抑制疟原虫裂殖子入侵红细胞。Garza等[10]对捻转血矛线虫抗性绵羊品种的研究表明，补体/抗体复合物通过幼虫聚集抑制幼虫运动，可能在捻转血矛线虫的早期幼虫清除中至关重要。Vignali等[11]用曼氏血吸虫感染大鼠模型，研究显示宿主补体在抗感染免疫中具有重要作用。可见，宿主血清抗体以及补体与各种效应细胞联合作用，增强了对体外培养早期童虫的杀伤作用[12-15]。我们前期对东方田鼠和BALB/c小鼠感染日本血吸虫尾蚴后血液的生化资料进行比较分析，结果表明东方田鼠血清补体与虫体在体内的消亡有相关性。因此，本研究进一步详细分析了东方田鼠感染日本血吸虫尾蚴前后补体因子C3、C4的血清含量和转录水平，补体活性等动态变化过程及其血清补体的杀虫作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级东方田鼠长江亚种，70 g，雄性，由上海实验动物研究中心提供；BALB/c小鼠，25 g，雄性，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；日本血吸虫中国大陆株尾蚴由中国农业科学院上海兽医研究所血吸虫病研究室提供。

1.2 主要试剂 小鼠补体蛋白3（C3）ELISA试剂盒、小鼠补体蛋白4（C4）ELISA购自江苏宝莱有限公司；绵羊红细胞、溶血素购自上海榕柏生物公司；1640培养基购自Hyclone公司；PrimeScriptTMRT-PCR Kit、SYBR®Premix ExTaqTMⅡ、EASY Dilution均购自TaKaRa生物工程（大连）有限公司。

1.3 日本血吸虫童虫回收 东方田鼠、BALB/c小鼠各25只，分别腹部攻击感染日本血吸虫尾蚴500条，感染后1、3、8、12、15 d用心脏灌注法冲洗肺脏和肝脏，收集童虫。分别采集腹部感染皮肤（大约2.25 cm2）、肺脏、肝脏，于PBS及培养基中洗涤3次，剪成米粒样大小，加入适量1640完全培养基（含5%胎牛血清、1%青链霉素），于5% CO2、37℃过夜培养；用200目铜筛过滤除去组织块，离心收集虫体，在显微镜下计数童虫数并计算虫体回收率：虫体回收率=回收童虫数÷感染尾蚴数×100%。

1.4 病理组织学检查 东方田鼠和BALB/c小鼠分别感染日本血吸虫尾蚴200条，并在感染后3、8、14 d各剖杀3只，分别摘取肺脏和肝脏整体，用10%福尔马林固定，常规方法制备石蜡切片，HE染色，光镜下观察虫体周围的组织细胞反应。

1.5 荧光定量RT-PCR分析补体因子的转录水平 分别收集感染血吸虫尾蚴后0、1、3、8、12 d的小鼠和东方田鼠肝脏，每组3个生物学重复。全部样品根据Invitrogen公司的RNA提取试剂盒提取RNA，最后溶于20 μL DEPC水，测定其RNA浓度。随后用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser反转录试剂盒合成cDNA，以制备的cDNA为模板，以管家基因GAPDH作为内参，采用SYBR Green荧光染料法，通过ABI 7500 real-time PCR反应仪检测目的基因在不同时期的转录水平，进行3次独立重复试验。引物由上海桑尼生物技术有限公司合成，其序列见表1。

表1 实时荧光定量 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.6 血清总补体溶血活性（CH50）测定 分别采集东方田鼠感染日本血吸虫尾蚴后1、3、8、12、15 d的血清，按照血清总补体溶血活性试剂盒说明书进行血清总补体活性的测定。2% 绵羊红细胞加等量溶血素（1∶2000），混匀，置37℃水浴30 min致敏绵羊红细胞。东方田鼠待测血清稀释度为1∶200[16]。按表2依次加各成分于96孔板中，最后1孔为非溶血对照，3次重复，混匀后置37℃孵育30 min。取出96孔板，400×g离心10 min，对照孔应不溶血。每孔取200 μL用多功能酶标仪检测OD值（波长542 nm），确定与标准孔最接近者为终点孔，然后按下公式计算CH50值：血清补体CH50（U/mL）=（1/血清用量）×稀释度。

表2 CH50检测体系Table 2 CH50 testing system

1.7 ELISA法测定血清C3、C4含量 根据ELISA试剂盒的使用说明方法，采用标准曲线法测定全部血清样品的的C3、C4含量。先将标准品依次稀释为1200、600、300、150、75 μg/mL ，然后利用试剂盒测定各浓度标准品和样品的OD值（波长492 nm）。根据标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品中的C3、C4实际浓度。

1.8 童虫体外培养与血清杀伤试验 日本血吸虫尾蚴置于50 mL 1640不完全培养基中，400×g离心5 min，弃上清液，保留5 mL下层液体和沉淀物，高速 涡震荡3 min，400×g离心1 min，重复3次。混匀后显微镜下观察断尾率达80%，然后加入20 mL1640不完全培养基洗涤3次。24孔板中每孔加入童虫300条，分别加入50 μL血清，37℃、5% CO2恒温培养箱培养30 min。最后加入培养基1 mL，37℃、5% CO2恒温培养箱培养48 h，用显微镜观察虫体活力，并对活、死虫体数进行计数，收集虫体备用。童虫培养液与0.4%台盼蓝溶液以9∶1混匀，染色5 min, 置光学显微镜下观察着色情况，并记录着色及未着色的童虫数。以下3种情况均判定童虫死亡：童虫内部结构不清，表膜被破坏，内容物呈放射状溢出；内部结构不清，表膜完整，但观察30 s左右未见活动；童虫虫体全部着色。童虫死亡率=死童虫数÷（死童虫数+活童虫数）×100%。

2 结果

2.1 两种宿主童虫回收率比较 两种宿主感染日本血吸虫尾蚴后，不同时间点童虫回收率差异较大。东方田鼠在感染后1、3、8、12、15 d的童虫回收率分别是15.04%、7.05%、8.33%、0.48%、0.72%，均低于BALB/c小鼠的童虫回收率：39.24%、38.56%、46.17%、19.02%、43%（图1）。小鼠各时间点的总童虫回收率相对稳定，而东方田鼠童虫回收率逐渐下降，直至虫体基本消亡。结果表明东方田鼠体内日本血吸虫的消亡是快速和渐进的过程，主要发生在感染尾蚴后1～3 d和8～12 d两个阶段。

图1 东方田鼠（A）和BALB/c小鼠（B）感染日本血吸虫尾蚴后童虫回收率Fig.1 Recovery rate of Schistosomula from Microtus fortis(A) and BALB/c mouse(B) infected with S. japonicum cercariae

2.2 感染尾蚴后肺和肝组织病理观察 东方田鼠感染日本血吸虫后d3，肺脏可见大量出血，偶见寄生虫栓子，肺间质充血水肿，炎细胞浸润，主要以嗜酸性粒细胞浸润为主；感染后d8，肺脏可见少量出血，肺脏内细支气管腔内积血，呈间质性肺炎；感染后d14肺脏组织中偶见钙化虫体，肝脏血管内可见组织细胞栓子，周围炎细胞浸润，形成嗜酸性脓肿，肝脏细胞多发灶性坏死。BALB/c小鼠感染后d3肺脏局部出血，间质性肺炎，间质纤维组织再生；感染后d8可见少量炎细胞浸润；感染后d14肺脏内嗜酸性粒细胞浸润，表现为小血管炎及血管周围炎。东方田鼠感染后d3肺脏出血、d14肝脏炎症反应都比相同时间点BALB/c小鼠严重（图2）。

图2 东方田鼠和BALB/c小鼠感染血吸虫后肺脏和肝脏组织病理切片（×200）Fig.2 The pathological tissue section of lung and liver from S. japonicum-infected Microtus fortis and BALB/c mouse(×200)

2.3 两种宿主感染日本血吸虫前后补体转录水平变化 东方田鼠感染尾蚴8 d后C3、C9、CD59和DAF的表达量高于感染前，而BALB/C小鼠无显著变化（图3）。C3和C9表达量升高说明东方田鼠补体在杀伤日本血吸虫过程中被激活，而且补体调节因子CD59和DAF相应增加，来调节补体系统的平衡。与BALB/C鼠相比，东方田鼠补体可能在杀伤体内血吸虫的过程中发挥了更重要的作用。

图3 东方田鼠和BALB/c小鼠感染前后补体相关分子转录分析Fig.3 Transcriptional analysis of complement molecule of Microtus fortis and BALB/c mouse before and after infection

2.4 东方田鼠感染前后血清补体活性及变化 东方田鼠感染尾蚴前和感染后1、3、8、12、15 d的血清CH50值分别为504、530、493、496、537 U/mL，结果表明东方田鼠感染血吸虫后血清补体活性没有显著变化（图4）。

图4 东方田鼠血清补体活性分析Fig.4 Analysis of complement activity of Microtus fortis sera

2.5 两种宿主感染日本血吸虫前后补体含量变化 东方田鼠和BALB/c小鼠感染日本血吸虫前后血清C3和C4含量变化如图5所示，结果表明两种宿主血清C3和C4 含量变化差异不具有统计学意义（图5）。

2.6 两种宿主血清杀伤日本血吸虫效果 东方田鼠血清孵育的日本血吸虫童虫死亡率为85.50%±7.15%，东方田鼠灭活补体血清孵育的童虫死亡率为60.99%±8.61%，BALB/c小鼠血清和小鼠灭活补体血清孵育的童虫死亡率分别为64.95%±7.70% 和62.26% ±7.80%（图6），结果表明东方田鼠血清对日本血吸虫童虫的杀伤作用高于灭活补体血清和BALB/c小鼠血清，差异具有极显著统计学意义（P<0.001）。

图5 东方田鼠和BALB/c小鼠感染前后血清C3（A）和C4（B）含量的ELISA检测结果Fig.5 Detection of C3(A) and C4(B) level in serum of Microtus fortis and BALB/c mouse by ELISA

图6 东方田鼠和BALB/c小鼠血清杀伤日本血吸虫童虫效果Fig.6 Killing effect of serum from Microtus fortis and BALB/c mouse on Schistosomula

3 讨论

了解防御寄生虫的机制是阐明宿主寄生虫相互作用的关键。日本血吸虫是一种人畜共患寄生虫，宿主范围自然宽广。在适宜宿主如小鼠和家兔体内，日本血吸虫尾蚴的发育率达到40%～70%，虫体能够发育至性成熟并交配产卵，在肝脏和肠壁中产生虫卵沉积。在不适宜宿主中如大鼠和猪体内，血吸虫的发育率较低，但依然有少量的虫体发育成熟（2%～10%）并产卵，能形成少量虫卵肉芽肿。东方田鼠是非常特异的日本血吸虫不适宜宿主，血吸虫尾蚴能侵入其体内，但移行到肝脏就不再发育，虫体开始消亡。感染20 d左右，东方田鼠体内已检查不到存活的虫体，肝脏、肠等组织均未检测到虫卵肉芽肿病理现象[17-19]。东方田鼠对日本血吸虫的抗性为研究宿主杀伤血吸虫，控制和限制感染的宿主-寄生虫相互作用提供了良好的系统模型，对其抗性机制的研究有可能为日本血吸虫病的防治提供新思路。

血吸虫童虫在终末宿主体内移行发育最终发育为成虫，根据其经过的靶器官和形态变化分为皮肤型童虫、肺期童虫和肝期童虫。李浩等[2]研究表明，血吸虫童虫在东方田鼠体内的移行也遵循同样的过程，但感染后18 d未能找到虫体。本研究表明血吸虫在东方田鼠体内的消亡过程是一个渐进的过程，感染后到达东方田鼠肺脏的童虫数量比BALB/c小鼠低很多（7.21% VS 16.86%），肝期童虫比同期BALB/c小鼠来源的童虫发育程度要低，体长、体宽数值较小，肠管分化程度很低，并且虫体逐渐消亡。我们认为，皮肤期（感染后第1～3 d）和肝期（感染后第8～12 d）是东方田鼠抗血吸虫两个非常重要的阶段。

补体系统是宿主免疫系统对抗病原体入侵的重要机制，是天然免疫的重要组分，具有快速和强烈的特点。Santoro等[21]研究表明，小鼠C3对曼氏血吸虫感染的虫负荷有显著的影响，C3和其他效应细胞引发的非特异性免疫在血吸虫感染初期，甚至在感染的前几个小时中具有重要作用。东方田鼠血清补体活性平均达到512 U/mL，显著高于小鼠和白兔等血吸虫适宜宿主，也明显高于大鼠、水牛等非适宜宿主。根据血吸虫童虫在感染后短时间内大量消亡的现象，我们推测其天然免疫特别是补体在杀伤血吸虫童虫中起到重要作用。血清补体的活性是和其补体分子的水平密切相关的。本研究结果显示，东方田鼠感染血吸虫尾蚴后，血清补体活性没有显著改变，这和相关补体分子的转录水平在感染后持续升高相匹配。刘金明等[22]研究结果表明，东方田鼠的血清补体对日本血吸虫童虫具有显著的杀伤作用，和本研究结果一致。目前，关于东方田鼠血清补体对血吸虫童虫的杀伤作用研究，都是在体外培养体系中进行，因此有必要应用补体抑制剂在东方田鼠体内抑制其血清补体，以进一步验证其对血吸虫的杀伤作用。根据启动因子的不同，补体激活通路分为经典途径、替代途径和凝集素途径等3条，其后续的补体级联反应的强烈程度和持续时间具有较大差异，在宿主抵抗病原体的过程中具有不同的作用，这3条途径在东方田鼠补体杀伤血吸虫中的作用也有待进一步探讨。