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小鼠胚胎毒性试验方法的建立及在评价中药早期胚胎毒性中的应用

2019-06-10黄珍祯张超超樊海艇朱娴丹汤家铭

医学信息 2019年9期
关键词:朱砂含药囊胚

黄珍祯 张超超 樊海艇 朱娴丹 汤家铭

摘要:目的  建立一種快速、早期的中药胚胎毒性的快速检测技术,用于中药的早期胚胎毒性筛选。方法  ①血清制备:SD大鼠随机分为阳性对照组4只,正常组4只,雄黄组、朱砂组各3只。阳性对照组给予环磷酰胺10 mg/kg,正常组用0.5%CMC-Na灌胃给药,雄黄组和朱砂组分别将雄黄和朱砂(用0.5%CMC-Na稀释)按1.0 ml/100 g灌胃给药。末次给药后1 h,无菌取血并取上清血清;②细胞采集:4~6周雌性C57小鼠,用妊娠孕马血清(PMSG)腹腔注射,48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG),合笼交配。第2天检查阴栓,用M2培养液将2细胞胚胎从输卵管中冲出,用M16培养液进行培养;③毒性试验:在胚胎2细胞阶段加入正常组、阳性对照组、雄黄组及朱砂组不同稀释比血清,观察囊胚成活率。结果  在1∶4、1∶16、1∶32的稀释比下,正常组的囊胚率为60.00%、73.33%、93.33%,高于阳性对照组的46.67%、60.00%、66.67%;朱砂组血清各个稀释比的囊胚率均未达到80%;除1∶512这个稀释比外,雄黄组血清各个稀释比2细胞胚胎的囊胚率均未达到80%。结论  ①朱砂和雄黄的大鼠含药血清在一定浓度时,对小鼠2细胞胚胎的生长发育有一定的影响,呈现中药的胚胎毒性;②小鼠胚胎2细胞用于中药的早期胚胎毒性筛选方法是可行的。

关键词:血清;胚胎毒性;2细胞胚胎;囊胚率

中图分类号:R285.5                                文献标识码:A                                  DOI:10.3969/j.issn.1006-1959.2019.09.023

文章编号:1006-1959(2019)09-0071-03

Abstract:Objective  To establish a rapid and early rapid detection technique for the toxicity of traditional Chinese medicine embryos for the early embryotoxicity screening of traditional Chinese medicine.Method  ① Serum preparation: SD rats were randomly divided into 4 positive control groups, 4 normal groups, and 3 rats in the realgar group and cinnabar group. The positive control group was given cyclophosphamide 10 mg/kg, the normal group was administered with 0.5% CMC-Na, and the realgar and cinnabar groups were respectively diluted with realgar and cinnabar (diluted with 0.5% CMC-Na) at 1.0 ml/100 g. Stomach administration. One hour after the last administration, the blood was taken aseptically and the supernatant serum was taken;②Cell collection: 4 to 6 weeks of female C57 mice were injected intraperitoneally with pregnant pregnant horse serum (PMSG). After 48 hours, human chorionic gonadotropin (hCG) was injected intraperitoneally and the cage was mated. On the second day, the sputum was examined, and the 2 cell embryos were washed out from the fallopian tube with M2 medium, and cultured with M16 medium; ③Toxicity test: normal group, positive control group, realgar group and cinnabar group were added at the embryonic 2 cell stage. The blastocyst survival rate was observed with different dilution ratios of serum.Results  At the dilution ratio of 1∶4, 1∶16, 1∶32, the blastocyst rate of the normal group was 60.00%, 73.33%, and 93.33%, which was higher than that of the positive control group (46.67%, 60.00%, and 66.67%). The blastocyst rate of each dilution ratio of serum did not reach 80%;Except 1∶512 dilution ratio, the blastocyst rate of each dilution ratio of 2-cell embryos in the realgar group was less than 80%.Conclusion  ①The serum containing cinnabar and realgar in rats has certain effect on the growth and development of mouse 2 cell embryos at a certain concentration, showing the embryotoxicity of traditional Chinese medicine; ②mouse embryo 2 cells used for early embryotoxicity screening of traditional Chinese medicine The method is feasible.

Key words:Serum;Embryo toxicity;2 cell embryo;Blastocyst rate

胚胎毒性(embryo toxicity)是指外来化合物在无明显母体毒性的剂量时,对胚胎或胎儿产生的损害。胚胎毒性表明该物质可通过胎盘屏障影响胚胎或胎儿的发育。胚胎毒性包括胚胎死亡、畸形、生长迟缓和功能不全。小鼠胚胎体外培养是胚胎技术的一部分,它包括超数排卵、胚胎的采集、胚胎体外培养等技术,常用于遗传工程小鼠的制备。由于小鼠的早期胚胎对培养环境变化(包括营养液、药物等)敏感,稍有改变容易引起胚胎发育停止、畸变等,目前将小鼠胚胎用作检测中药胚胎毒性方面的研究少见报道。小鼠2细胞胚胎发育到囊胚需要72 h,在2细胞阶段加入实验中药给药大鼠的血清,如中药(经或未经体内代谢的)有毒成分对早期胚胎具有毒性,则会引起胚胎的发育停滞、畸形甚至死亡。本项实验的目的在于建立一种快速、早期的中药胚胎毒性的快速检测技术,可用于中药的早期胚胎毒性筛选。

1材料与方法

1.1实验动物  清洁级雄性SD大鼠,14只,体重300~350 g;清洁级雄性ICR小鼠,体重33~37 g;清洁级雌性C57小鼠,4~6周龄,以上实验动物均由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供[实验动物生产许可证号:SCXK(沪)2008-0016]。动物购入后,饲养在清洁级动物实验室内[实验动物使用许可证号:SYXK(沪)2009-0069],温度控制在20~25℃,湿度控制在40%~70%。动物自由摄食、饮水,1周换1~2次垫料。

1.2试剂和耗材  HCG,批号:100618;PMSG,批号:100912,均购自杭州动物药品厂。M2操作液,批号:082012;M16培养液,批号:042012,均购自Sigma公司。0.22 μm滤芯、1.5 ml灭菌离心管等耗材均购自上海青阳生物科技发展有限公司。

1.3方法

1.3.1含药血清的制备  按照血清药理学制备含药血清的“通法”制备含药血清。将SD大鼠分为阳性对照组4只,正常组4只,雄黄组、朱砂组各3只。阳性对照组给予环磷酰胺10 mg/kg,正常组用0.5%CMC-Na灌胃给药,雄黄组、朱砂组分别将雄黄和朱砂(用0.5%CMC-Na稀释)按1.0 ml/100g灌胃给药。末次给药后1 h,3%戊巴比妥钠麻醉,用无菌注射器腹主动脉采血,在超净工作台上注入到无菌离心管内。置室温待血液凝固后,3000 rpm离心15 min。取上清血清,混合后置新的无菌离心管内进行分装,保存于-70℃冰箱内。根据情况测定含药血清中砷和汞的含量。

1.3.2小鼠超数排卵、2细胞胚胎的采集  4~6周雌性C57小鼠,下午2~4时用妊娠孕马血清(PMSG)腹腔注射,48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(HCG),将雌鼠分别放入清洁级雄性ICR小鼠笼内进行交配。第2天上午8~9时检查阴栓,有阴栓的雌鼠处死后取输卵管,用M2培养液将2细胞胚胎从输卵管中冲出,培养液清洗,M16培养液培养。

1.3.3小鼠早期胚胎发育毒性试验方法的建立  在胚胎2细胞阶段分别加入不同组别不同稀释比血清,观察囊胚成活率。①正常2细胞胚胎发育到囊胚的技术的建立,囊胚发育率需达到90%以上;②将大鼠正常组血清和阳性对照血清做比较,1:4稀释正常组血清,囊胚发育率可达到80%以上,阳性血清囊胚发育率要达到80%则稀释血清至少在1:16以上;③将雄黄组与朱砂组含药血清进行比较,观察在不同稀释比下,雄黄组和朱砂组囊胚发育率情况,判断是否具有胚胎毒性。

2结果

2.1大鼠正常组血清和阳性对照组囊胚率比较  在1∶4、1∶16、1∶32的稀释比下,正常组的囊胚率高于阳性对照组,说明阳性药物的含药血清对二细胞胚胎的生长发育有影响,可能是含药血清中的有毒成分对早期胚胎具有毒性,引起胚胎的发育停滞、畸形甚至死亡,见表1,见表2。

2.2朱砂含药血清组囊胚率的试验结果  朱砂组各个稀释比的囊胚率不高,均未达到80%,在1∶2稀释比时,囊胚率只有33.33%,说明朱砂的含药血清对二细胞胚胎的生长发育有一定的影响。随着含药血清浓度的降低,囊胚率并没有随之升高,不具有一定的线性关系,见表3。

2.3雄黄含药血清组囊胚率的试验结果  在雄黄含药血清各稀释比下,除1∶512外,二细胞胚胎的囊胚率均未达到80%,说明雄黄的含药血清对二细胞胚胎的生长发育也有一定的影响,但随着含药血清浓度的降低,囊胚率随之升高,对细胞的影响也随之降低,见表4。

3讨论

生殖健康与安全妊娠直接关系到优生优育以及国家和民族未来的兴衰。20世纪60年代初震惊全球的 “反应停事件” 导致近万名新生儿出现海豹肢畸形的沉痛教训,唤起了人类对药物致畸作用的高度警惕。随着现代科学技术的发展, 国内外学者对妊娠安全性的研究越来越深入,最主要的研究目标是外源性物质的胚胎毒性。准确、便捷的胚胎毒性检测方法将为科研工作者提供良好的工具。

中医药要现代化和国际化,必须要用现代实验技术来研究其毒性及其毒性成分,以保障人们用药的安全。在几千年的传承过程中,中医药对妇女妊娠期用药特别注意,总结出将妊娠禁忌药分为禁用与慎用两大类。禁用中药多系剧毒药,或药性作用峻猛之品,及堕胎作用较强的药,如水银、砒霜、雄黄、轻粉、斑蝥、马钱子、蟾酥、川乌、草乌、藜芦、胆矾、瓜蒂、巴豆、甘遂、大戟、芫花、牵牛子、商陆、麝香、干漆、水蛭、虻虫、三棱、莪术等;慎用中药则主要是活血祛瘀药、行气药、攻下药、温里药中的部分药,如牛膝、川芎、红花、桃仁、姜黄、牡丹皮、枳实、枳壳、大黄、番泻叶、芦荟、芒硝、附子、肉桂等。現代生殖毒理学研究也证实一些中药如槟榔、芦荟、杜仲、山慈菇、雄黄、半夏、红花、大黄、狼毒、大蓟、熟地黄、羌活、茵陈蒿、川桂皮、牡丹皮、苦参、连翘、桔梗等,具有生殖或胚胎发育毒性。同时,因为体内胚胎毒性试验需要使用大量实验动物、费用较高、试验周期长、难以迅速对大量物质进行毒性评价,不能满足减少(Reduction)、替代(Replacement)和优化(Refinement)的3R原则需要。而体外试验具有简便、经济、试验周期短、试验条件可控、剂量-反应关系易测和排除母体干扰等优点,已广泛应用于胚胎毒性的筛选和致畸机制的研究。

说本次实验主要是尝试将小鼠2细胞胚胎用作检测中药的胚胎毒性。由于小鼠的早期胚胎对培养环境变化敏感,稍有改变容易引起胚胎发育停止、畸变等。在胚胎发育的2细胞阶段加入实验中药给药大鼠的血清,如中药(经或未经体内代谢的)有毒成分对早期胚胎具有毒性,则会引起胚胎的发育停滞、畸形甚至死亡。此实验中,正常血清组随着血清浓度的降低,囊胚率随之升高,而阳性组含药血清对胚胎发育有明显的抑制作用,雄黄、朱砂的含药血清对胚胎发育也有一定的抑制作用,但其中的比例关系尚不明确,也未呈现出明显的线性关系。有可能是实验人员的操作技术尚未熟练,在具体的操作过程中,由于胚胎的敏感性,有些不注意的小因素都可能会对胚胎造成影响。如果此方法能成功建立,便能应用于中药的早期胚胎毒性的筛选,对于中药的胚胎毒性研究有着重要意义。

参考文献:

[1]高海霞,相珊,吴海萃,等.枸杞子提取液对体外培养小鼠早期胚胎发育的影响及机制探讨[J].山东医药,2018,58(18):30-32.

[2]洪洁薇,郝璐,贾功雪,等.左归丸含药血清对小鼠早期胚胎体外发育的影响[J].中华中医药杂志,2017(3):1017-1020.

[3]范晶晶,郑秋闿.牛磺酸对昆明小鼠早期胚胎体外发育和着床的影响[J].上海交通大学学报(农业科学版),2016,34(1):11-15.

[4]韩倩倩,尹艳云,王涵,等.囊胚培养液对小鼠胚胎的毒性:体外生殖辅助医疗器械安全性评价[J].中国组织工程研究,2015,19(16):2598-2602.

[5]蒋德菊,罗艺,鲍倩,等.川芎含药血清对小鼠胚胎干细胞增殖和分化的影响[J].广州中医药大学学报,2017,34(3):401-404.

[6]陈喜英,郭永昌,刘田福.不同时间注射PMSG和HCG对小鼠超排卵效果的影响[J].山西医科大学学报,2014,45(1):23-25.

[7]宋殿荣,王雅楠,張崴,等.小半夏加茯苓汤含药血清对小鼠胚胎干细胞体外增殖及分化的影响[J].天津中医药,2011,28(6):486-488.

[8]刘晓坤,张骏鸿,魏强,等.不同起始时间超数排卵处理的昆白小鼠排卵、受精和胚胎发育时程研究[J].农业生物技术学报,2014,22(9):1097-1105.

收稿日期:2019-1-9;修回日期:2019-2-20

编辑/成森

基金项目:上海中医药大学科技实验中心新技术新方法项目资助

作者简介:黄珍祯(1988.9-),女,上海人,本科,助理实验师,主要从事实验动物饲养与管理工作

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