5-氟尿嘧啶卟啉锰/锌配合物的合成、光电性质及抗癌活性

任丽磊 彭晓霞 王树军 肖立伟 李泽强

(廊坊师范学院化学与材料科学学院，廊坊 065000)

5-氟尿嘧啶(5-FU)是临床使用的广谱抗癌药物，它能抑制胸苷酸合成酶，干扰DNA和RNA的合成，已成功应用于肠癌、胃癌、乳腺癌等实体癌的治疗[1]。但由于首过代谢显著、脂溶性低、对癌细胞选择性差，影响抗肿瘤疗效。为了降低其毒副作用，科研工作者对5-FU进行了大量的化学修饰[2-4]，结果表明，将5-FU适当衍生化，可提高其选择性，降低毒副作用。

另一方面，卟啉及金属卟啉是一种重要而特殊的物质，具有独特的生物活性。对卟啉进行功能分子设计、合成，在光动力疗法[5-6]及抗癌方面[7-8]备受关注，有着十分广阔的应用前景。利用卟啉对恶性肿瘤有特殊的亲和力[7]这一特点，将其与抗癌药物相连，组成卟啉-抗癌药物的二元体系，是近年来卟啉化学的研究热点之一，这种二元体系包括卟啉-BNCT体系，卟啉-顺铂体系，卟啉-蒽醌体系[9-11]等。研究表明，组合分子的抗癌疗效远远大于2种药物同时使用时的疗效。

基于这些考虑，本文合成了一种新型的5-氟尿嘧啶卟啉化合物(L)及其锰配合物(MnL)、锌配合物(ZnL)，对目标化合物的结构进行了表征，研究了它们的光、电性质和抗癌活性。以期为筛选新的抗癌药物提供一定的基础数据支持。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

BRUKER AVANCE 400型核磁共振仪；Agilent 6520 QTOF LC/MS质谱分析仪；Shimadzu-2550紫外-可见分光光度计；WGY-10型荧光分光光度计；Prestige-21傅立叶变换红外光谱仪；CHI660C电化学工作站。

吡咯和 1，2-二溴乙烷 (使用前重蒸)，5-氟尿嘧啶(用前重结晶)，所有试剂均为市售分析纯。5-邻羟基苯基-10，15，20-三苯基卟啉(A)和 5-邻(2-溴乙氧基)苯基-10，15，20-三苯基卟啉(B)参照文献[12]合成。

1.2 化合物的合成

目标化合物的合成路线如Scheme1所示。

Scheme 1 Synthetic routes of the ligand and complexes

1.2.1 5-(2-(5-氟尿嘧啶-3-基)乙氧基苯基)-10，15，20-三苯基卟啉(L)的合成

在100 mL干燥的圆底烧瓶中，加入130 mg(1 mmol)5-氟 尿 嘧 啶 和 30 mL N，N-二 甲 基 甲 酰 胺(DMF)，搅拌使之溶解。加入焙烧过的无水K2CO3166 mg(1.2 mmol)，于 80 ℃搅拌 1 h，使 5-氟尿嘧啶生成钾盐。然后加入88 mg(0.12 mmol)5-邻(2-溴乙氧基)苯基-10，15，20-三苯基卟啉，升温至 120 ℃，搅拌，10 h后停止。饱和NaCl溶液盐析，抽滤，蒸馏水洗涤，干燥。粗产品用柱色谱分离，用氯仿与丙酮体积比为4:1的混合液淋洗，收集第二色带，旋蒸干燥，得紫色晶体L 23 mg，产率为22%。1H NMR(CDCl3，400 MHz):δ-2.74(s，2H，Pyrrole N-H)，4.10～4.12(t，2H，OCH2)，4.30～4.31(t，2H，-NCH2)，7.75～7.78(m，4H，ArO-o，m，p-H),7.99(s，1H,C-H in 5-FU),8.21～8.31(m,15H,Ar-H),8.81～8.83(m,8H,Pyrrole-H)；HRMSESI(m/z):[M+H]+787.282 6，按 C50H35FN6O3计算值:787.282 7；UV-Vis(CHCl3):λmax/nm(ε/(L·mol-1·cm-1)):418(3.66×105)，514(1.46×104)，549(4.87×103)，589(3.41×103),644(1.95×103)；IR(KBr,cm-1):ν(NH)3 471，ν(CH)2 924，ν(CO)1 637，ν(C=C)1 517，ν(COC)1 136。

1.2.2 金属配合物MnL、ZnL的合成

在50 mL圆底烧瓶中，加入25 mg(0.032 mmol)化合物 L、20 mL二氯甲烷，再加入 63 mg(0.32 mmol)氯化锰溶于甲醇制成的饱和溶液，电磁搅拌下回流，反应1 h。冷却，蒸馏水洗涤，分液。有机层水浴蒸干。粗产品用氯仿与丙酮体积比为4∶1的混合液洗脱。收集最浓绿色带，旋蒸浓缩，干燥得绿色固体MnL 17 mg，产率为63.6%。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+839.197 0,按C50H33FN6O3Mn计算值:839.197 3;UV-Vis(CHCl3):λmax/nm(ε/(L·mol-1·cm-1)):478(1.67×105)，580(1.15×104)，622(1.03×104)；IR(KBr，cm-1):ν(NH)3 412，ν(CH)2 922，ν(CO)1 637，ν(C=C)1 570,ν(COC)1 240，ν(Mn-N)1 010。

按上述方法，用59 mg(0.32 mmol)乙酸锌代替氯化锰，得紫红色固体ZnL 21.8 mg，产率为80.3%。1H NMR(CDCl3，400 MHz):δ4.12～4.13(m，2H，OCH2),4.22～4.30(m，2H，-NCH2),7.60～7.64(m，4H，ArO-o，m，p-H)，7.85(s，1H，C-H in 5-FU)，8.18～8.24(m，15H，Ar-H)，8.67～8.69(m，8H，Pyrrole-H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+848.188 4,按C50H33FN6O3Zn计算值:848.188 4;UV-Vis(CHCl3):λmax/nm(ε/(L·mol-1·cm-1)):419(3.83×105),547(1.48×104),583(1.23×103);IR(KBr，cm-1):ν(NH)3 471,ν(CH)2 924,ν(CO)1 637,ν(C=C)1 575，ν(COC)1 261，ν(Zn-N)997。

1.3 荧光光谱的测定

以三氯甲烷为溶剂，配制浓度为10μmol·L-1的溶液进行荧光光谱的测定。荧光光谱测试条件:室温，样品池为1 cm×1 cm×4 cm石英池，激发狭缝10 nm，发射狭缝10 nm，激发波长为420 nm，负高压:450 V，扫描范围:550～750 nm。

1.4 电化学测试

本实验中循环伏安法实验条件如下:采用三电极体系，玻碳电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。以二氯甲烷为溶剂，样品浓度为 1 mmol·L-1,支持电解质为 0.1 mol·L-1四丁基高氯酸铵，扫描速率50 mV·s-1，测定前用高纯氩气除去体系中的氧气，在氩气气氛下进行循环伏安测试。

1.5 抗癌活性测试

胎牛血清购自北京元亨圣马生物技术研究所，RPMI-1640培养液购自Invitrogen公司，SRB购自Sigma公司，酶标仪(MD公司，M5型)。人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株Bel-7402和人结肠癌细胞株HCT-8均购自中国医学科学院基础研究所细胞中心。

应用磺酰罗丹明B蛋白染色法(SRB法)检测目标化合物对癌细胞(A549、Bel-7402和HCT-8)增殖生长的抑制作用。步骤如下:接种对数生长期细胞于96孔培养板中，37℃，5%(V/V)CO2培养24 h。药物处理孔加入10μL样品溶液 (终浓度:化合物为5 μg·mL-1；混合物为 50 μg·mL-1)，阳性药物孔加入终浓度为5μg·mL-1的5-FU进行处理；对照孔加入含等体积溶媒的培养基，37℃，5%(V/V)CO2培养72 h。弃去培养基，轻轻加入100μL 4℃预冷的50%TCA固定细胞。先静置5 min，然后再移至4℃放置1 h。倒掉固定液，蒸馏水洗涤5次去除TCA，空气干燥1 h。每孔加入0.4%SRB溶液80μL，室温染色30 min。弃染液，1%醋酸洗涤5次充分去除未结合的SRB，空气干燥。加入150μL 10 mmol·L-1Trisbase(pH=10.5)溶解，用M5酶标仪于510 nm波长下测定OD值，以下列公式计算细胞生长抑制率(Ri):

2 结果与讨论

2.1 紫外可见吸收光谱

从实验部分紫外数据可以看出:(1)自由卟啉的紫外可见光谱有1个Soret带和4个Q带。在418 nm处的强吸收是Soret带，由电子从基态S0跃迁到最低激发单重态S2产生；在500～650 nm之间的吸收带是Q带，由电子从基态S0跃迁到最低激发单重态S1产生，这些是卟啉的特征光谱；(2)自由卟啉与Mn2+、Zn2+配位后，Q带吸收峰由4个减少到2个。这是由于当金属离子与自由卟啉配位后，形成N-M键，配合物的对称性由D2h变为D4h，且能级靠近，表现为QⅠ、QⅣ谱带消失，同时Soret带发生一定程度的位移。紫外光谱的明显变化说明金属离子与自由卟啉配位，生成了金属配合物[13]；(3)与锌配合物相比，锰配合物的Soret带红移至478 nm。分析原因为:2种金属离子的相对离子半径顺序为Mn2+(88 pm)＞Zn2+(74 pm)， 而电负性 Mn2+(1.5)＜Zn2+(1.6)，因此锰对外层价电子的束缚力较弱，使得电子更易流向卟啉环，从而使卟啉环上的电子云密度升高，降低电子跃迁所需要的能量，使得Soret带红移较多[14-15]。

2.2 红外光谱

根据文献[16]对3种化合物的红外特征吸收光谱进行了经验归属，数据见实验部分。在自由卟啉中，1 637 cm-1处的吸收峰是5-FU中羰基的伸缩振动吸收峰，同时在1 136 cm-1处有醚键的特征吸收峰，这表明5-FU是以成醚的方式与卟啉侧端的乙氧链相连。而锰配合物、锌配合物的红外光谱数据中，分别在1 010和997 cm-1处出现了新的强伸缩振动吸收峰，该峰归属于卟啉环内Mn-N键和Zn-N键的振动吸收，这表明卟啉环内的2个氢原子被金属取代形成了稳定的金属卟啉配合物。

2.3 核磁共振氢谱

3种化合物的核磁共振氢谱数据列于合成部分，由数据可知:自由卟啉中环内N-H的化学位移在-2.74处，与卟啉环上苯环相连的2个-CH2的化学位移值分别是4.10～4.12和4.30～4.31，5-FU中的C-H在7.99处出现，而5-FU中的N-H由于没有处在屏蔽区，故它的δ为正，应在9以上。但由于受溶剂的影响，积分比又小，该峰未显示出来。再对比锌配合物的氢谱数据，与锌离子配位后，吡咯环内NH的化学位移消失，这是形成金属锌卟啉配合物的重要证据[17]。

2.4 荧光光谱

卟啉具有典型的双荧光性质(S2→S0和S1→S0)。通常，S2→S0荧光只有在低温和极稀的溶液中才能得到，本实验得到的是S1→S0荧光。图1只给出了自由卟啉和锌配合物的荧光发射光谱图。从图1可知，自由卟啉的发射峰位于651和715 nm处，与吸收光谱中Q带成镜像对称。而锌配合物的发射峰出现在599、645 nm处，与自由卟啉相比，荧光特征峰蓝移50～60 nm，同时荧光强度减弱，说明锌配合物具有一定的荧光猝灭性质[17]。这是由于当卟啉环与锌配位后，吡咯N原子通过σ电子的给予与Zn2+形成配位键，同时，Zn2+通过d电子的给予与N原子形成反馈π键，由于形成的反馈π键可以使卟啉环上的共轭体系的π电子密度增加，从而使荧光特征峰峰位发生改变并产生荧光猝灭效应。而具有顺磁性的锰配合物却观察不到荧光发射光谱，这是因为顺磁性金属卟啉配合物中π-π*激发单重态与中心金属的多重态之间发生较强的相互作用，使系间窜跃速率增大，导致最低激发单重态到基态的跃迁几率降低，产生荧光猝灭[18]。

图1 化合物L(a)、ZnL(b)的荧光光谱图Fig.1 Fluorescence spectra of compounds L(a)and ZnL(b)

2.5 电化学性质

为了研究金属离子对卟啉配合物电化学性质的影响，用循环伏安法测试了3种化合物的电化学性质，测定结果及循环伏安曲线分别见表1和图2。从图2可以看出，自由卟啉和锌配合物图形相似，在负电位区间，均呈现2对准可逆的氧化还原峰，对应于2个单电子还原过程。在正电位区间，自由卟啉呈现1对准可逆的氧化还原峰，而锌配合物呈现2对准可逆的氧化还原峰。由表1可以看出，化合物L和ZnL的第一氧化峰和第一还原峰的差值分别为2.24和2.14 V，这与通常用来鉴定卟啉环发生氧化还原反应的ΔE1/2=(2.25±0.15)V相一致[19]，也与Zemer等[20]的分子轨道理论计算值2.18 V一致。说明自由卟啉与锌配合物具有相同的电极反应过程，电子转移反应在卟啉环上进行，被氧化成π阳离子或还原为π阴离子，并进一步还原为二价阴离子。

表1 化合物L、MnL和ZnL在CH 2Cl2溶剂中的氧化还原电势数据Table 1 Redox potentials of L,MnL and ZnL in CH 2Cl2 V

图2 化合物L(a)、MnL(b)和ZnL(c)的循环伏安曲线图Fig.2 Cyclic voltammograms of compounds L(a),MnL(b)and ZnL(c)

锰配合物MnL的循环伏安曲线形状与自由卟啉相差很大。基于中心金属离子先于卟啉环氧化还原的观点，可认为其第一还原反应发生在金属Mn上，而其它氧化还原反应发生在卟啉环上[21]。

从表1还可以看出，自由卟啉的第一还原半波电位E1/2为-1.23 V，而锰配合物与锌配合物的第一还原半波电位E1/2分别变为-1.52和-1.40 V，这是因为卟啉配体与金属离子配位后对称性增大，卟啉环更加稳定，还原较难进行，因而需要更高的负电位才能将其还原[22]。

2.6 目标化合物对肿瘤细胞的抑制活性

采用SRB法测定了3个化合物对人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株Bel7402和人结肠癌细胞株HCT-8的抑制活性，结果见表2。从表2可知:(1)样品浓度为10μg·mL-1时，3个化合物对Bel7402和HCT-8均有一定的抑制作用，而MnL对A549有一定抑制作用，自由卟啉和锌配合物对A549的抑制率为负值。3个化合物抑制活性均低于阳性对照药5-氟尿嘧啶，分析原因可能是目标化合物对细胞株的抑制有很强的选择性，对上述3种细胞株选择性较差，对其他细胞株的抑制活性将在后续工作中进行。(2)锰配合物对3种细胞株的抑制率明显高于自由卟啉和锌配合物，抑制率分别为24.32%、34.16%和23.54%，说明卟啉化合物的抗肿瘤活性与中心金属离子有关，锰卟啉对癌细胞的抑制活性较锌卟啉和自由卟啉要高很多，这与文献[16]所得结论一致。(3)锰配合物对人肺癌细胞株A549的抑制率最高，为34.16%，也表明卟啉化合物的抗肿瘤活性具有一定的选择性，对不同的肿瘤细胞的作用机理可能不一样。(4)与文献[16]对比，发现抑制率均低于文献值，说明当苯环上连有给电子基时对这3种细胞株的抑制率较大。与肿瘤DNA作用机制可能是:卟啉化合物优先以空间匹配及静电作用与DNA螺旋小沟中连续的AT(A=腺嘌呤，T=胸腺嘧啶)富碱基区域进行沟槽结合[23]，其抗肿瘤活性与它们和DNA相互作用的强弱、结合模式及中心金属离子种类均有关。

表2 化合物L、MnL和ZnL对A549、Bel7402和HCT-8的抑制率Table 2 Inhibition rates of L,MnL and ZnL to A549,Bel7402 and HCT-8%

3 结 论

通过亲核取代反应合成了5-氟尿嘧啶修饰的自由卟啉L及其金属配合物MnL和ZnL，采用现代分析测试手段表征了其化学结构。研究了目标化合物的荧光性质和电化学性质；测试了它们的抗癌活性。结果表明:金属离子对卟啉的荧光性质有显著影响，锌配合物荧光强度减弱，而具有顺磁性的锰配合物荧光信号消失；锰配合物的循环伏安曲线与自由卟啉、锌配合物不同，除了卟啉环发生氧化还原外，还发生了金属离子的氧化还原反应；锰配合物较其他2种化合物有明显的抗癌作用。

致谢:抑制活性由中国医学科学院药物研究所国家药物筛选中心测试，特此感谢。