香连丸对急性溃疡性结肠炎小鼠氧化应激介导的细胞自噬的影响研究*

韩 莹 蔡庆宇 张 岩

（1.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.黑龙江省佳木斯市中医院，黑龙江 佳木斯 154002；3.佳木斯大学附属第二医院，黑龙江 佳木斯 154002）

自噬（Autophagy）是真核细胞内独有的自我保护机制，是细胞利用溶酶体降解大分子物质和自身受损细胞器的一种高度保守的进化过程［1]。自1963年比利时学者克里斯汀·德·迪夫首次提出 “自噬”的概念至今，细胞自噬的研究已经成为生物医学最热门的领域之一［2]。在自噬过程中，细胞质的一部分被吞噬泡吞噬后形成双膜结构自噬体，再与溶酶体融合后形成自噬溶酶体，从而降解自噬体的内容物。自噬降解后的产物可以作为细胞器和新蛋白质的合成原料，在肠上皮细胞的损伤修复和维持肠道内环境的稳态上面发挥着重要的作用［3]。

活性氧（ROS）是生物体内一类活性含氧物质和氧代谢产物的总称，包括超氧阴离子（O2-）、羟基（OH-）和过氧化氢（H2O2）等［4]。 由 ROS 介导的氧化应激反应参与机体多个生理病理过程，是导致炎症反应、组织损伤、细胞凋亡的重要因素之一［5]。作为溃疡性结肠炎（UC）病理过程中的一个重要环节，过度的氧化应激反应与UC急性期肠道黏膜中性粒细胞的活化和募集密切相关［6]。因此，本研究通过采用香连丸干预葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的急性UC模型，通过检测氧化应激指标及自噬相关蛋白的表达，进一步明确两者的内在关联及香连丸的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只无特异病原（SPF）级C57BL/6小鼠，体质量（22±2）g，8周龄，购于黑龙江中医药大学动物实验中心，动物合格证批号：SCXK（黑）2015003。饲养于黑龙江中医药大学佳木斯学院实验中心，饲养条件二级，恒温恒湿，常规喂养。

1.2 试药和仪器 1）试药：美沙拉嗪缓释颗粒（法国爱的发制药集团，国药准字：H20143164，500 mg/袋），配制成美沙拉嗪混悬液。香连丸（李时珍医药集团有限公司，国药准字：Z42020426，主要成分：萸黄连、木香，6 g/袋），药物经研磨后配制成香连丸混悬液；DSS购于上海翊圣生物科技有限公司；丙二醛（MDA）含量试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）活力检测分析试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠Beclin-1、LC3II、LC3I和p62单克隆抗体购于英国Viva Bioscience公司；兔抗大鼠β-actin、HRP标记山羊抗兔IgG和高敏ECL化学发光试剂盒购于沈阳万类生物科技公司。2）仪器：光学显微镜购于日本Olympus公司；电泳仪、电泳槽和凝胶成像分析系统均购于北京六一生物科技有限公司。

1.3 分组与造模 采用随机数发生器，将C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组、美沙拉嗪组、香连丸低剂量组、香连丸中剂量组和香连丸高剂量组，每组10只。除空白组外，余下各组均参照文献［7]中方法复制急性UC模型。具体方法如下：5%DSS溶液连续饮用7 d，改为蒸馏水连续饮用10 d，每隔1 d更换一次新鲜配制DSS溶液。空白组小鼠给予蒸馏水连续饮用15 d。

1.4 药物干预 造模期间，根据人-小鼠体表面积比例换算。美沙拉嗪组给予美沙拉嗪混悬液20 mg/（kg·d）灌胃治疗，香连丸用药剂量参照文献［8]中用量，低、中、高剂量组分别给予香连丸混悬液 1.6、3.2、6.4 g/（kg·d）灌胃治疗，空白组和模型组则给予0.001 mL/kg的蒸馏水灌胃，连续灌胃给药15 d。

1.5 标本采集 各组小鼠于造模开始之日每日称重，并观察大便性状及便血情况。于末次给药结束后，禁食不禁水12 h，采用10%水合氯醛腹腔麻醉后，收集回盲部至肛缘的结肠组织，用于检测。

1.6 观察项目 1）疾病活动指数：疾病活动指数（DAI）评分参照文献［9]，具体如下：根据体质量的减少量（＜1%，1%～5%，5%～10%，10%～15%和＞15%）分别计 0、1、2、3、4 分，大便性状（正常、软便、便溏）和便血情况（潜血阴性、潜血阳性和肉眼血便）分别计0、2、4分，总分0～12分，分值越高，病情越重。2）结肠组织病学观察：处死小鼠后取一部分结肠组织，10%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，常规HE染色。并根据参考文献［10]中标准，对结肠组织进行组织学损伤评分。该评分从溃疡分级、病变深度、炎症、纤维化和肉芽组织5个方面进行评分，总分0～10分，分值越高，病情越重。3）MDA的表达和SOD、GSH-px的活性检测：取部分结肠组织，加抽提缓冲液，4℃电动匀浆，15 000 r/min离心20 min，取上清液，采用生化法测定MDA的表达和SOD、GSH-px的活性。具体实验方法参照试剂盒说明书。4）Western blotting法检测结肠组织中自噬相关蛋白表达：取部分结肠组织，RIPA裂解，均浆，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳、转膜，封闭。 加入 Beclin-1（1∶1 000）、LC3II（1∶1 000）、LC3I（1∶1 000）、p62（1∶1 000）和 β-actin（1∶500）一抗，孵育过夜12 h。缓冲液洗涤，加入HRP标记的二抗HRP标记山羊抗兔IgG，洗涤，ECL发光，显影，凝胶成像系统拍照，Image J软件分析各蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，计算各蛋白的相对表达度。

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

图1 各组小鼠结肠组织病理学观察（HE染色，200倍）

2.1 各组小鼠结肠组织病理学观察 见图1。正常组小鼠结肠黏膜结构清晰，杯状细胞丰富，腺体排列规整；模型组黏膜结构紊乱，杯状细胞减少，腺体破坏伴有大量炎性细胞的浸润。各治疗组小鼠结肠黏膜损伤较模型组均有不同程度的改善，杯状细胞增加，腺体破坏减轻，炎性细胞减少，其中以香连丸高剂量组改善最佳。

2.2 各组小鼠DAI及组织学损伤评分比较 见表1。造模后，模型组小鼠DAI及组织学损伤评分显著增高，与空白组比较差异均具有显著统计学意义（P＜0.01）；美沙拉嗪组及香连丸各剂量组小鼠DAI及组织学损伤评分均显著降低，与模型组比较差异均具有显著统计学意义（P＜0.01）。

表1 各组小鼠DAI及组织学损伤评分的比较（分，±s）

表1 各组小鼠DAI及组织学损伤评分的比较（分，±s）

与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同

组 别 n DAI 组织学损伤评分空白组 10 0.80±1.03 0.40±0.52模型组 10 9.20±1.69** 6.50±2.27**美沙拉嗪组 10 4.10±1.79△△ 3.00±2.21△△香连丸低剂量组 10 7.00±1.89△△ 4.20±2.20△△香连丸中剂量组 10 5.00±1.15△△ 3.80±1.32△△香连丸高剂量组 10 3.80±1.23△△ 1.50±1.08△△

2.3 各组小鼠结肠组织中氧化应激指标比较 见表2。造模后，模型组小鼠结肠组织中MDA的表达显著增加，SOD及GSH-px的活性显著降低，与空白组比较差异均具有显著统计学意义（P＜0.01）；美沙拉嗪组及香连丸各剂量组均能显著减少结肠组织中MDA的表达，增加SOD及GSH-px的活性，与模型组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05和P＜0.01）。香连丸各剂量组中，以香连丸高剂量组疗效最佳。

表2 各组结肠组织中氧化应激指标的比较（±s）

表2 各组结肠组织中氧化应激指标的比较（±s）

组 别 n MDA（mmol/mg）空白组 10 10.06±1.86模型组 10 38.74±6.86**美沙拉嗪组 10 19.93±4.24△△香连丸低剂量组 10 30.18±5.33△△香连丸中剂量组 10 26.62±3.28△△香连丸高剂量组 10 16.40±3.09△△SOD（U/mg） GSH-px（U/g）53.82±9.79 199.35±15.20 19.73±3.53** 125.69±8.35**41.28±5.03△△ 164.19±7.24△△24.83±3.80△ 137.18±9.45△29.93±4.68△△ 138.60±13.05△△43.06±5.67△△ 162.49±8.33△△

2.4 各组小鼠结肠组织中自噬相关蛋白表达的比较见表3，图2。造模后，模型组小鼠结肠组织中Beclin-1、LC3Ⅱ、p62蛋白的表达及LC3Ⅱ/LC3I的比值显著降低，LC3Ⅰ蛋白的表达显著增加，与空白组比较差异均具有显著统计学意义（P＜0.01）；美沙拉嗪组及香连丸各剂量组均能上调Beclin-1、LC3Ⅱ、p62蛋白的表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，下调LC3I蛋白的表达，与模型组比较差异均具有统计学意义 （P＜0.05和P＜0.01）。

表3 各组结肠组织中自噬相关蛋白表达的比较（±s）

表3 各组结肠组织中自噬相关蛋白表达的比较（±s）

组 别 n空白组 10模型组 10美沙拉嗪组 10香连丸低剂量组 10香连丸中剂量组 10香连丸高剂量组 10 Beclin-1/β-actin 1.00±0.10 0.27±0.07**0.75±0.14△△0.49±0.06△△0.66±0.09△△0.87±0.14△△LC3Ⅰ/β-actin LC3II/β-actin 0.82±0.14 1.15±0.27 1.62±0.37** 0.51±0.07**1.21±0.27△△ 1.86±0.36△△1.36±0.25△ 0.79±0.11△1.17±0.18△△ 1.01±0.22△△0.92±0.18△△ 3.42±0.72△△LC3Ⅱ/LC3Ⅰ p62/β-actin 1.41±0.34 0.95±0.18 0.28±0.07**0.40±0.10**1.55±0.58△△ 0.90±0.14△△0.58±0.16 0.57±0.08△△0.87±0.11△ 0.69±0.14△△3.77±1.24△△ 1.19±0.21△△

图2 各组小鼠结肠组织中自噬相关蛋白的表达

3 结 论

氧化应激指体内在受到各种有害刺激的情况下，抗氧化和氧化作用的失衡，活性氮簇和反应性氧化物消除减少、生成过多，从而引起组织损伤的一个重要病理过程［11]。同时，作为炎症反应的一个病理过程，氧化应激与炎性因子相互促进，炎性能够通过氧化作用使氧化应激反应扩大化，而氧化应激又能诱导炎性因子的大量释放［12]。MDA作为组织氧化损伤的指示剂，是脂质过氧化物的分解产物，能够引起细胞膜结构和DNA的破坏、蛋白质的交联和变性［13]。SOD和GSH-Px作为重要的过氧化物分解酶，能够有效地清除体内的氧自由基，抑制肠道组织脂质过氧化反应，从而起到保护结肠组织屏障的功能［14]。

研究证实，氧化应激反应和自噬之间存在着复杂的关联，活性氧能够通过一系列途径参与细胞自噬过程，并通过降解各种被氧化的蛋白以减轻氧化应激引起的细胞损伤。Beclin-1是哺乳动物参与自噬的特异性基因，通过与PI3K形成复合体参与ATG蛋白在自噬前体中的定位，并通过促进自噬小泡的成核和招募细胞溶质中的蛋白调节自噬的活性。作为自噬体膜上的标记蛋白，LC3通常以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的形式存在于细胞内。自噬体形成后，散在分布于细胞质中的LC3Ⅰ通过偶联磷酸酰乙醇胺形成LC3Ⅱ，并定位于自噬体的内膜和外膜上，直至与溶酶体融合，因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在一定程度上反映了机体的自噬水平［15-18]。

本研究中我们发现，香连丸能够显著改善由DSS诱导的小鼠结肠组织形态，降低DAI及组织学损伤评分。同时香连丸通过减少结肠组织中MDA的表达，增加SOD及GSH-px的活性，增加组织抗氧化的能力，减轻氧化应激反应引起的黏膜损伤。在自噬水平，我们发现伴随着UC小鼠氧化应激反应的增加，其自噬水平受到抑制，而香连丸各剂量均能上调Beclin-1、LC3Ⅱ、p62蛋白的表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，下调LC3Ⅰ蛋白的表达，诱导细胞发生自噬，从而减轻组织损伤。

综上所述，我们认为香连丸在治疗UC方面具有显著的疗效，能够显著改善结肠组织损伤，其作用机制可能是通过降低氧化应激反应和促进细胞自噬实现的。