抗CarP抗体、抗PAD4抗体对类风湿关节炎的诊断价值

韩红梅, 李捷， 许闫， 李艳， 袁玉华

天津市第五中心医院 1输血科， 2检验科(天津 300450)； 3天津医科大学总医院空港医院检验科(天津 300307)； 4天津医科大学总医院检验科(天津 300052)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性的、炎性多关节滑膜炎为主的自身免疫性疾病，引起骨和软骨的破坏，常导致关节畸形。RA的发病机制尚不明确，大量研究表明，RA的发病及进展与多种自身抗体有关[1-3]。我们依据病史、临床以及影像学表现来诊断RA，但RA患者早期症状不明显，容易漏诊误诊，耽误治疗，导致患者在疾病后期关节变形，甚至丧失劳动力。因此早发现、早治疗对疾病控制及预后有重要意义。RA患者在早期未发生关节病变时，血清中就可以检测到一些自身抗体。目前常用的类风湿关节炎检测指标有类风湿因子(rheumatoid factor，RF)及抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide antibody，CCP)抗体等，但仍有一部分患者这两项指标阴性，这要求我们寻找敏感度和特异度更高的实验室指标，使得RA患者能够在早期被发现。近几年研究发现，在早期 RA 患者血清中检测出抗氨甲酰化蛋白(carbamylated protein，CarP)抗体[4-5]，且与病程的轻重有明显的相关性[6-8]。肽酰基精氨酸脱亚氨酶(peptidyl arginine deiminase,PAD)催化蛋白中的精氨酸转化为瓜氨酸，与人类患病密切相关。研究表明，RA患者血清中存在抗PAD4(peptidyl arginine deiminase type 4，PAD4)抗体[9]，提示其参与疾病发展过程。本研究通过用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测 RA 患者血清中抗 CarP 抗体及抗PAD4抗体，探讨两者对RA的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018年8月27日至2018年8月30日天津医科大学总医院空港医院500例健康体检者外周血标本，作为对照组，其中男435例，女65例，年龄21～65岁，平均(35.30±7.72)岁。选取2018年1月1日至2018年9月30日就诊于天津医科大学总医院空港医院、天津市第五中心医院、天津医院共计129例RA患者(RA组)外周血标本，其中男17例，女112例，年龄23～80岁,平均(53.31±12.39)岁。以上入选患者均符合2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟(ARA/EULAR)修订的 RA 诊断标准，排除伴有严重感染、肿瘤、糖尿病、高血压、高脂血症或其他代谢病等。

1.2 主要试剂及仪器 96孔酶标板购自美国COSTAR公司，PAD4抗原蛋白购自SIGMA公司，包被液、显色剂、终止液均购自北京索莱宝科技有限公司，二抗(羊抗人IgG)购自北京博奥森技术有限公司，胎牛血清购自HyClone公司。瑞士TECAN公司洗板机、酶标仪。

制备Carp：胎牛血清氨甲酰化。将胎牛血清总蛋白浓度稀释至4 mg/mL，加入氰酸钾，使氰酸钾浓度达到1 mol/L，置于37℃恒温箱内，12 h。将氨甲酰化后的胎牛血清透析18 h。透析后置于-80℃冰箱，备用。

1.3 研究方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测所有标本血清。

1.3.1 患者基本资料的收集 登记每例入组患者的一般人口学资料(包括姓名、性别、年龄)及实验室指标，包括病程、抗CCP抗体、RF结果。

1.3.2 血清的收集 抽取体检人员及患者清晨空腹外周静脉血5 mL，室温条件下静置10 min，3 500 r/min离心20 min，收集上清液，储存于-80℃环境中。

1.3.4 血清抗Carp抗体、抗PAD4抗体的测定 用包被液将Carp、PAD4稀释至10 μg/mL，分别包被于96微孔板内，2℃过夜。用含0.05%吐温20的PBS(PBS-T)洗板5次，每孔加入以PBS-T稀释至10%的胎牛血清，2℃封闭6 h。洗板5次，加入患者及健康体检者血清，每孔50 μL，血清按1∶50比例以封闭液稀释，2℃过夜。洗板5次，加入羊抗人IgG。用封闭液将二抗以1∶12 000比例稀释，每孔加入50 μL，室温2 h，避光。洗板5次，加入显色剂室温避光10 min,加入终止液，在450 nm立即读取吸光度值。

2 结果

2.1 抗PAD4抗体、抗CarP抗体ELISA实验阳性判定界值 标本血清抗PAD4抗体、抗CarP抗体检测的吸光度值分别>0.32、0.49时，判断为阳性标本。

2.2 抗PAD4抗体、抗CarP抗体对RA诊断价值的分析 PAD4、CarP及CCP、RF单一项目及组合项目检测RA组标本血清，RF、CCP联合CarP检测出的阳性例数最多。CCP、RF联合PAD4与CCP、RF两项指标检测出的阳性例数无差别。CarP可以检测出抗CCP抗体、RF、抗PAD4抗体均阴性的3例RA组标本。见表1。

抗CarP抗体单独检测RA组标本血清的特异度高于抗PAD4抗体、CCP+RF单一及组合检测RA组标本血清的特异度。CCP+RF联合CarP检测RA组标本血清的敏感度高于CCP+RF单独检测RA组标本血清的敏感度。见表2。

2.3 抗PAD4抗体、抗CarP抗体、CCP+RF单一及组合诊断价值比较 RA组中抗PAD4抗体、抗CarP抗体、抗CCP抗体+RF单一及组合的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比见表2。

表1 RA组及健康对照组中抗PAD4抗体、抗CarP抗体、抗CCP抗体+RF单一及组合检测结果 例

表2 抗PAD4抗体、抗CarP抗体、抗CCP抗体+RF单一及组合诊断价值比较

3 讨论

RA是常见的、以全身性炎症和存在自身抗体、病变累及多关节的自身免疫性疾病。如不能及早发现治疗，会导致患者关节不可逆损伤，丧失劳动力，因此对RA的早期诊断和治疗显得尤为重要。RA患者如果能够早发现，在疾病临床症状发生发展之前进行治疗，可以降低骨关节侵略性损害的程度，有效控制疾病发展[10-11]。

一些自身抗体在RA患者发病数年前就已存在，RF、CCP是目前比较常用的诊断RA的检测指标，但仍有一部分RA患者血清两者的检测结果为阴性，而且这两种自身抗体在一些关节疼痛的非RA患者中也出现阳性结果[12]，这需要我们找到新的检测指标与CCP、RF联合检测，以提高诊断RA的敏感度和特异度。近几年， 研究发现，RA患者体内存在一种抗CarP抗体[4-5]。CarP不同于CCP，CCP是PAD4催化精氨酸转化为肽酰瓜氨酸而产生，过程属于酶促反应。而CarP的产生是一个化学反应的过程，即在氰酸盐的介导下，赖氨酸转变为高瓜氨酸，这个化学反应过程被称为氨基甲酰化，氰酸盐在氨基甲酰化过程中是必要的、重要的条件。人体生理情况下，尿液中含有氰酸盐，与尿素成化学动态平衡，所以氰酸盐在人体内的含量很低，不会引起大量氨基甲酰化。但在炎症情况下，中性粒细胞会释放大量的髓过氧化物酶，该酶会催化氰酸盐的产生，使机体氰酸盐合成增加，导致蛋白广泛的氨基甲酰化[13]，蛋白结构和功能发生改变，引发病理反应。研究发现[14-15]，约45%的RA患者能检测到IgG型抗Carp抗体，43%的RA患者能检测到IgA型抗Carp抗体。更重要的是，约16%ACPA(anti-citrullinated protein anti-body,ACPA)阴性的RA患者IgG型抗Carp抗体阳性，30%ACPA阴性的RA患者IgA型抗Carp抗体是阳性结果。由此可见，抗Carp抗体对RA的早期诊断有比较重要的价值。

ACPA是一组抗环瓜氨酸蛋白抗体，包括抗CCP抗体、抗角蛋白抗体、抗核周因子等。PAD4是一种翻译后修饰酶，可以催化蛋白质肽链中的精氨酸残基脱亚氨基而变成瓜氨酸残基，这个过程就是瓜氨酸化。RA患者针对体内的瓜氨酸化抗原发生免疫反应，产生ACPA。PAD4就是通过促进ACPA产生来参与RA发病[16]。

本研究检测129例RA患者血清中RF、抗CCP抗体、抗PAD4抗体、抗Carp抗体，旨在研究实验室常用的检测指标CCP、RF以外，联合PAD4、Carp两项指标，能否提高诊断RA的敏感度和特异度。发现抗PAD4抗体、抗CarP抗体检测RA组标本血清的敏感度分别是34.11%、31.78%，特异度分别是95.60%、96.40%。RF+抗CCP抗体的特异度为92.40%，PAD4和CarP较RF+CCP有更好的特异性。目前对于RA患者抗CarP抗体的研究结果各异，国外多名学者研究其敏感度、特异度波动在35%～69.2%、91%～98%[14，17]，本实验结果与其实验室结果相近。国内相关研究发现[18]抗CarP抗体诊断RA的敏感度为46.3%，特异度为93.1%，相较于本研究的结果，敏感度略高，特异度略低，可能是由于该研究用于实验的CarP购自试剂公司，蛋白纯度较高，而本实验的CarP是本实验室自己制备的，导致敏感度结果略低，特异度结果略高可能是因为正常对照组标本量较大的原因。本研究发现RF+CCP诊断RA的敏感度是91.47%，联合抗CarP抗体检测的敏感度是93.80%，联合抗PAD4抗体，敏感度无变化。3例抗CCP抗体、RF、抗PAD4抗体均为阴性的RA患者血清中检测到抗CarP抗体。可以看出，抗CarP抗体能够部分弥补RF、抗CCP抗体阴性辅助RA的诊断。国外有研究发现，存在抗Carp抗体而ACPA阴性的RA患者，疾病活动度可能会增加而且会发生更加严重的关节损伤[19]，表明抗CarP抗体具有辅助估测患者预后的价值。本研究虽然没有发现在RA组抗PAD4抗体对RF、抗CCP抗体阴性的标本的辅助诊断作用，但相关研究发现PADI4基因与RA的易感性相关[20]，患者体内存在IgG型抗PAD4抗体，与RA患者放射学进展相关[9]，本实验证实了RA患者体内确实存在IgG型抗PAD4抗体。国内有学者研究[21]IgG型抗PAD4抗体对RA的诊断价值，其敏感度和特异度均低于本研究结果。实验可以看出，PAD4不仅通过将精氨酸蛋白瓜氨酸化产生ACPA来参与RA的发病，本身也作为独立的自身抗原参与机体免疫反应，参与RA的发生发展。本研究用CarP、PAD4同时检测RA患者血清，是目前国内较新的实验研究，旨在探索两者对RA患者的诊断价值。国内对于CarP、PAD4的研究较少，判断两者阳性截断值的方法大多是以健康人群均数值加2倍标准差来确定，本研究也是采用这个方法来界定阳性值，这个方法只考虑了阴性人群，可能会出现假阳性。目前还是没有标准化的CarP、PAD4抗原的制备和抗体检测流程，需要我们进一步的研究。

综上所述，抗CarP抗体、抗PAD4抗体对诊断RA有较好的特异度，抗CarP抗体对于RF、抗CCP抗体、抗PAD4抗体阴性的早期RA患者具有重要的临床意义[22-24]。对于CarP、PAD4怎样导致RA的发生发展，两者与RA的内在联系还不十分明确，有待进一步探索。