苏丹草及高丹草幼苗对干旱胁迫的生理响应与抗旱性比较

朱永群，彭丹丹，彭 燕，张新全，陈仕勇，许文志，姚 莉，王 谢，林超文

（1. 四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2. 四川农业大学动物科技学院，四川 成都 611130；3. 西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

苏丹草(Sorghum sudanense)为禾本科高梁属一年生草本植物，因具有分蘖能力强、再生性好、营养价值高和适口性好等优点，可多次刈割青饲或青贮，也可用于调制干草利用[1]，已成为许多国家及我国干旱和半干旱地区畜牧业发展的重要饲料作物，也是南方地区“粮改饲”种植模式的优选牧草之一。高丹草 (S. bicolor×S. sudanense)为苏丹草与高粱种间杂交产生的杂种类型(2n=2x=20)，属于高光效C4植物[2]，因综合了亲本高粱的茎粗、叶宽与苏丹草的分蘖及再生能力强等特性而具有明显的杂种优势，目前在我国东北、西北、华北以及长江以南地区都有广泛的种植，甚至可替代苏丹草使用。高丹草性喜温暖湿润气候，虽其本身具有一定的耐旱性，但干旱作为主要的逆境因子之一，严重影响了种子萌发与幼苗阶段对环境的适应能力，从而对其后期的生长发育和产量具有直接或间接的影响[3-4]。因此开展幼苗期耐旱种质的筛选和鉴定对优质高产的苏丹草及高丹草的推广与应用具有重要的意义。

目前，已建立了多种方法应用于作物的抗旱性评价，常用方法包括田间直接鉴定法、旱棚或人工气候室法、盆栽鉴定法和间接鉴定法等，由于前3种方法普遍存在试验周期长和易受环境影响等缺点，而通过形态学指标、产量指标以及生理生化指标间接评价和鉴定作物的抗旱性具有简单、快速和准确的特点，在加速植物抗旱鉴定和抗旱育种进程中具有重要的意义[5]。赵娜等[6]通过测定细胞膜相对透性、游离脯氨酸(Pro)含量及供试材料在干旱和复水过程中茎秆倒伏和叶片萎蔫等表观生长状况的变化共3项生理指标对6份高丹草品种进行了抗旱性评价。桂枝等[1]通过测定生长早期幼苗的存活率、相对株高和地上部鲜重3项指标对22份苏丹草材料进行耐旱性评价，研究发现幼苗存活率和地上部干质量与苏丹草生长早期的抗旱性具有显著的相关性。李源等[7]根据全生育期的生长性状、产量以及牧草品质等指标对5份高丹草品种进行抗旱性研究，结果表明不同指标对应的各品种抗旱性顺序存在一定的差异。Bibi等[8]以水势、渗透势、叶片膨压、气孔导度、根长和茎长6项指标为依据对10份苏丹草材料进行了抗旱性评价。这些研究大多是通过干旱胁迫下不同指标值的大小来评价苏丹草、高丹草的抗旱性。而植物抗旱是一个极其复杂的生理过程，简单的比较某一指标或某几个指标值的大小难以反映植物的真实抗旱水平。隶属函数分析法则提供了一条在多指标测定基础上对材料抗旱特性进行综合评价的途径，近年来已广泛应用于多种植物的抗旱性评定[9-12]，但迄今为止应用于苏丹草和高丹草等禾本科牧草的抗旱性筛选和评价还少有报道。

本研究以苏丹草和高丹草共12份材料为研究对象，对干旱胁迫下幼苗期叶片相对含水量、电导率、丙二醛含量、叶绿素含量、叶绿素荧光(Fv/Fm)、净光合速率和水分利用效率等生理生化指标进行分析，并应用隶属函数法根据各指标隶属值的平均值大小对材料的抗旱性进行综合评价，为苏丹草及高丹草抗旱新品种选育和优质牧草的栽培提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究选用农业部全国畜牧总站国家牧草种质基因库提供的8份苏丹草材料和1份高丹草材料(编号为1-9)，以及四川省农业科学院土壤肥料研究所已有的3份材料(其中1份为苏丹草，其余2份为育成的新品种高丹草材料)，共12份，材料详情如表1所列。

1.2 试验设计

试验于2017年9月至12月在四川省农科院土壤肥料研究所土壤与耕作饲草实验室内进行，采用沙培法对种子幼苗进行培育。种子经1%次氯酸钠消毒5 min后用蒸馏水润洗几次，选取100粒均一的种子均匀播撒在盛有石英砂的塑料育苗盆(长20 cm，宽 13 cm，高 8 cm)中，于 24 ℃ 光照培养箱内萌发，温度设置为白天26 ℃，夜晚22 ℃，时长各为12 h，湿度为65%。待种子出苗后更换为Hoagland全营养液培养，每2 d更换一次营养液，待幼苗长至20 d左右(第3片成熟叶片完全展开)，选取长势一致的材料用渗透势为-0.4 MPa含PEG-6000的Hoagland全营养液进行为期6 d的干旱胁迫处理，对照组(CK)采用Hoagland全营养液进行正常培养。试验设置3次重复，于干旱胁迫6 d(基于前期预试验得知该时间点植株表型性状差异最为明显)分别对CK和处理组进行取样并测定相关生理指标。

表1 供试材料详情Table 1 Plant materials for this study

1.3 测定指标及方法

叶绿素荧光(Fv/Fm)采用便携式调制叶绿素荧光仪 (MINI-PAM-II, Heinz WALz, NH, Germany)于黑暗条件下测定，测定前将材料置于避光环境下1.5 h进行暗适应处理。植物叶片净光合速率(Pn)和蒸腾速率(Tr)使用便携式光合测定仪(LI-6400, LICOR Inc.,Lincoln, NE, USA)，测定条件的光合有效辐射 (PAR)、温度和 CO2浓度分别设定为 1 200 μmol·(m2·s)-1、23 ℃和 400 μmol·L-1。测量时间从 10:30开始，每份材料随机选取10个叶片进行测定[13]。水分利用效率(WUE)根据公式WUE=Pn/Tr计算。

叶片相对含水量 (relative water content, RWC)采用烘干法，根据公式RWC=(鲜重-干重) / (饱和鲜重-干重) × 100% 计算[14]；电解质渗透率 (electrolyte leakage,EL)使用电解质渗透仪根据煮前电导率与煮后电导率的百分比计算[15]；叶绿素含量(chlorophyll content)采用乙醇-丙酮浸提法测定[16]。

丙二醛(malondialdehyde, MDA)测定前需进行粗酶液的提取。即0.1 g鲜叶片经液氮速冻并用组织研磨机捣碎，再加入1.5 mL预冷的含1%聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)的磷酸缓冲溶液 (150 mmol·L-1，pH 7.0)充分冰浴研磨，4 ℃ 下 15 000 r·min-1离心 20 min，上清液即为粗酶提取液于冰浴中待测。MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定[17]；

1.4 数据分析

利用模糊隶属函数值法，分别求出12份材料各项指标的具体抗旱隶属值，再对每份材料各项指标的隶属值进行累加求出平均值，即得出平均抗旱隶属值，对材料的抗旱性进行综合评价。平均抗旱隶属值越大，则材料的抗旱性越强。

所测指标与抗旱性呈正相关关系，计算公式：Xij=(X-Xmin) / (Xmax-Xmin)；与抗旱性呈负相关，计算公式则为Xij= 1-(X-Xmin) / (Xmax-Xmin)。式中:Xij表示i材料j指标的抗旱隶属函数值，X表示i材料j指标的测定值，Xmax和Xmin分别表示所有材料在某一指标测定值内的最大和最小值[9, 18]。

采用Excel 2006进行绘图与数据处理；SAS 8.0软件对相对含水量，相对电导率、丙二醛、叶绿素含量等指标进行方差分析和显著性检验(P＜ 0.05)。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对苏丹草及高丹草幼苗叶片相对含水量的影响

相对含水量(RWC)的变化直观地反映了植物在逆境胁迫下体内水分的亏缺程度。正常条件下叶片相对含水量维持在96%左右，干旱胁迫使得叶片相对含水量较 CK 显著降低 (P＜ 0.05)(图1)，但因材料不同下降幅度各有差异。其中受干旱胁迫影响较小的为1、2、3和12号(‘海狮’)苏丹草以及11号‘蜀草1号’高丹草，与CK相比分别降低了50.64%、54.58%、55.27%、54.23%和54.0%；而7号和8号苏丹草以及9号高丹草的叶片相对含水量受干旱胁迫影响则较显著，分别较其对照降低了67.54%、69.33%和73.66%。

图1 干旱胁迫对供试材料叶片相对含水量的影响Figure 1 Effect of drought stress on relative water content in the leaves of the different materials

2.2 干旱胁迫对苏丹草及高丹草幼苗相对电导率和丙二醛含量的影响

图2 干旱胁迫对供试材料相对电导率和丙二醛含量的影响Figure 2 Effect of drought stress on electrolyte leakage and malondialdehyde content in the leaves of the different materials

干旱胁迫使得叶片相对电导率和MDA含量显著增高(P＜ 0.05)，但不同材料增长幅度各异(图2)，干旱胁迫下2和12号(‘海狮’)苏丹草及10(‘蜀草2号’)和11号(‘蜀草1号’)高丹草的叶片相对电导率分别比CK增高了74.74%、69.28%、和65.99%、80.73%，增长幅度较小；而7号、8号两份苏丹草以及9号高丹草的增长幅度为最高，分别较CK增高了123.5%、112.33%和118.0%。

干旱胁迫下叶片MDA含量的增长趋势同电导率类似，增长幅度较小的为3号和12号(‘海狮’)苏丹草以及10(‘蜀草 2号’)和 11号 (‘蜀草 1号’)两份高丹草，分别较其CK增高了283.27%、266.39%和188.46%、239.62%，而增幅较大者为6号和8号两份苏丹草及9号高丹草，分别较CK增长了392.93%、431.01% 和 421.35%(图2)。

2.3 干旱胁迫对苏丹草及高丹草幼苗叶绿素含量的影响

干旱胁迫下叶绿素含量显著降低(P＜ 0.05)。与各自的对照相比，干旱胁迫使得12份材料的叶绿素含量分别降低了63.38%、60.82%、56.05%、56.90%、60.67%、61.58%、64.99%、62.77%、85.70%、64.15%、61.74%和61.29%，可知下降幅度较小的材料为3和4号苏丹草，下降幅度最大的为9号高丹草材料(图3)。

2.4 干旱胁迫对苏丹草和高丹草幼苗光合作用参数的影响

干旱胁迫引起植物光化学活性显著降低(P＜ 0.05)。干旱胁迫下12份材料最大光化学效率(Fv/Fm)分别较对照下降了20.95%、20.92%、22.88%、19.92%、25.02%、33.40%、37.30%、47.13%、60.02%、25.80%、19.59%和27.0%，可知降低幅度较小的为3份苏丹草材料[1、2和4号(‘乌拉特1号’ )]以及11号‘蜀草1号’高丹草材料，降低幅度较大的为7号和8号苏丹草及9号高丹草材料(图4)。

图3 干旱胁迫对供试材料叶绿素含量的影响Figure 3 Effect of drought stress on chlorophyll content in the leaves of the different materials

干旱胁迫抑制光合反应途径的进行，导致净光合速率和水分利用率均显著降低(P＜ 0.05)(图4)。与对照相比，干旱胁迫下12份材料的净光合速率依次降低了 21.03%、24.83%、14.70%、19.74%、17.84%、25.23%、40.96%、34.50%、41.24%、13.32%、21.25%和15.85%，水分利用效率依次降低了31.27%、30.30%、27.62%、25.10%、23.56%、39.24%、58.00%、58.39%、60.81%、26.87%、27.53%和31.15%，两项指标下降幅度较大的均为7和8两份苏丹草及9号高丹草材料，降低幅度最小的为3、4、5和12号(‘海狮’)4份苏丹草以及10号‘蜀草2号’高丹草材料。

图4 干旱胁迫对供试材料光合作用参数的影响Figure 4 Effect of drought stress on photosynthetic parameters of the different materials

2.5 隶属函数法对苏丹草及高丹草材料耐旱性的综合评价

根据12份供试材料的7项指标计算抗旱隶属函数平均值得出综合排名(表2)，材料编号1、2、3苏丹草和11号‘蜀草1号’高丹草的隶属函数平均值分别为0.89、0.85、0.87和0.98，综合排序列于前 4名；4(‘乌拉特 1号’)、5和 12(‘海狮’)苏丹草及10号‘蜀草2号’高丹草次之，隶属函数平均值介于0.7～0.8，综合排名居于5～8位；9号高丹草所有指标的测定值在各项指标内均为最小，其抗旱隶属值计算结果为“0”，因而排名最后。

3 讨论与结论

植物的抗旱性与体内的水分含量密切相关，其不仅反映了在缺水环境下植物因蒸腾作用耗水机体组织的运水和恢复能力，还指示了植物的保水性能，因而相对含水量被认为是鉴定植物抗旱性的综合有效指标之一[19]。同时植物在干旱环境下机体因缺水会迅速积累大量的活性氧(ROS，如O2-、H2O2、·OH和1O2等)，生成强氧化性的脂质过氧化物和小分子降解物，引发和加剧膜脂过氧化程度，细胞膜结构和稳定性遭到破坏，MDA作为膜脂过氧化产物之一，通常和电解质渗透率一起作为衡量细胞膜结构受损程度的重要指标[20-21]。因而相对含水量与MDA和相对电导率在衡量植物的抗旱性过程中负相关。植物受干旱胁迫的影响程度越大，电解质渗透率和MDA含量越高，抗旱能力则越弱[3, 22]，而抗旱性较强的植物则能维持较高的相对含水量和相对较低的相对电导率及MDA含量[23-24]。本研究结果也刚好印证了这一点，干旱胁迫下供试材料相对含水量的变化与相对电导率和MDA含量的变化正好相反，材料2、3和12号(‘海狮’)苏丹草以及两份高丹草 10(‘蜀草 2号’)和 11(‘蜀草1号’)的RWC受干旱胁迫降幅较低，MDA含量和相对电导率升高的较少，说明该5份材料在干旱胁迫下具有较好的维持细胞膜结构和相对稳定的特性以及较强的保水性能，表现出较强的抗旱性。而7、8号苏丹草以及9号高丹草则与之相反，因而受干旱胁迫的影响最大，其抗旱性则弱。

植物光合作用的实现依赖于叶绿素对光能的吸收，干旱胁迫下叶绿素含量降低可能一方面源于叶绿素的生物合成减弱，另一方面可能为植物体内活性氧的积累引起膜脂过氧化加速了叶绿素的分解[25]。因而干旱胁迫下叶绿素含量的变化不仅可用来指示植物对干旱胁迫的敏感性，还可在一定程度上反映植物的生产性能和受干旱胁迫的影响程度[26]。叶绿素含量随着干旱胁迫程度的加剧而降低，而抗旱性强的品种(系)具有维持较高叶绿素含量的能力，这与其他牧草和作物的研究结果相一致[25, 27-28]。迄今为止将叶绿素含量的变化应用于植物抗旱性评价较少，且在高粱属植物的抗旱性评价中还未曾应用过此项指标。本研究结果显示，干旱胁迫导致叶绿素含量显著降低，但抗旱性强的材料叶绿素含量降幅较小。

表2 12份供试材料各指标隶属函数值及耐旱性综合评价Table 2 Subordinate function and comprehensive identification of drought resistance capacity of 12 cultivars

植物在胁迫环境下光合系统Ⅱ反应中心光化学活性的降低主要体现在PSⅡ电子传递速率的降低。研究表明，PSⅡ光化学效率(Fv/Fm)是指示植物受光抑制和逆境胁迫程度的探针[29]，近年来已运用于小麦(Triticum aestivum)[30]、苏丹草和高丹草[31]等多种作物的抗旱评价中。众所周知光合作用是植物生长的物质基础，其强弱决定了牧草最终的品质和产量。干旱胁迫影响植物叶绿体光化学反应特性和光合途径的正常运行，导致光合速率降低，且随着干旱胁迫程度的加剧，净光合速率下降幅度增大，付芳婧等[32]在玉米(Zea mays)的抗旱性评价中研究发现叶片净光合速率的抗旱指数与抗旱隶属度呈正相关关系，邬爽等[33]的研究表明，水分胁迫下抗旱性强的小麦品种能维持较的高净光合速率和水分利用效率。本研究结果表明，12份供试材料叶绿素荧光(Fv/Fm)、净光合速率和水分利用效率受干旱胁迫的影响均显著降低，其中编号7、8的苏丹草和9号高丹草该指标的下降幅度较为一致且较为明显，说明其在干旱胁迫下光合性能较弱，而材料编号1、2、3、4号(‘乌拉特1号’)苏丹草与 10(‘蜀草 2号’)和 11(‘蜀草 1号’)高丹草以及12(‘海狮’)苏丹草共7份材料总体的光合作用参数降幅较低，说明其在干旱胁迫下能维持较强的光合性能，因而表现出较强的抗旱性。胡举伟等[31]在比较高丹草与苏丹草两种牧草叶片PSⅡ光化学活性的抗旱优势研究中表明，干旱胁迫下高丹草具有更好地维持PSⅡ光化学活性的特性；另也有关于高粱苏丹草杂交种在干旱胁迫下光合机能明显优于亲本苏丹草的报道[34]。而本研究中并非所有高丹草的光合性能都优于苏丹草，与先前报道略有出入，其原因可能是先前的试验选材存在一定的局限性，以及本研究因供试材料亲本关系不详不具有可比性。

植物抗旱反应涉及多个生理生化方面的过程，不同品种(系)的某一具体指标对干旱胁迫的反应不一定相同，不同指标之间还存在着显著的相关性[35]。综合试验结果来看，虽然相同抗旱类别的材料总体上各项生理生化指标受干旱胁迫的影响变化较为一致，但依据单一指标对材料的抗旱性排序又不尽相同，说明以单一指标评价植物的抗旱性强弱具有一定的局限性和片面性，因而本研究根据供试材料的各项生理生化指标采用隶属函数加权平均法对材料的抗旱性进行综合评价，消除了个别指标带来的片面性，使参试材料的抗旱差异具有可比性，从而提高了材料抗旱鉴定结果的准确性和可靠性。鉴定结果为材料编号为1、2、3的苏丹草和 10(‘蜀草 2号’)、11(‘蜀草 1号’高丹草)、12(‘海狮’苏丹草)抗旱性较强，编号为7、8的两份苏丹草和9号高丹草抗旱性较弱。

综上所述，本研究虽初步得出了12份供试苏丹草及高丹草的抗性比较结果，但植物的抗旱性评定仅依据实验室内的生理生化指标存在一定的局限性，可进一步借助田间多年多点试验结合植物形态指标和产量指标进行综合分析，以期筛选出抗旱性强、优质高产的牧草材料。