绿原酸对变形链球菌抑制作用的体外实验研究*

陈昱敏，许斯华，张 泽，刘锦婷，顾 瑜，白国辉

(1.遵义医科大学珠海校区口腔医学系，广东 珠海 519041;2.贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室，贵州 遵义 563000)

龋病是人类的常见病及多发病，是世界范围内的一种重要的公众健康问题[1]，而变形链球菌(Streptococcus mutans) 是公认的导致龋病最主要的致病菌[2]，通常以菌斑生物膜的形式存在，粘附于牙齿表面，并持续产酸，导致牙釉质脱矿，最终形成龋坏，因此抑制变形链球菌可达到预防龋坏的目的。

漱口是常用的自我菌斑控制方法，目前在口腔临床常用的具有抗菌能力的漱口液大多以抗生素、乙醇等为功能成分[3],长期使用易引起抗药性、菌群失调、黏膜刺激等问题。因此,寻找有效、安全、并且可长期使用的天然防龋药物作为漱口液已经成为控制菌斑的研究重点。

基于此背景，越来越多的学者将目光转向中草药。在我国,中草药资源丰富、运用历史悠久，许多药物如茶多酚、鱼腥草等因其具备杀菌消炎作用且毒副作用小而广泛应用于基础研究以及临床实践。姜东等研究表明，金银花提取物绿原酸能够对不同血清型的变形链球菌菌株产生抑菌或杀菌作用[4]。

本实验探究绿原酸对变形链球菌的抑菌效果，并希望将绿原酸作为主要成分制备一种新型漱口水。

1 材料与方法

1.1菌种来源本实验供试细菌变形链球菌由贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室提供。

1.2材料来源BHI 购自舜友(上海)生物技术有限公司， 按标准方法配成 BHI 培养基。绿原酸(批号 JS90022)由上海金穗生物科技有限公司公司提供，绿原酸纯度≥98%，用无菌水配成相应浓度的药液，现配现用。氯己定漱口水购自深圳南粤药业有限公司，含氯己定1.2%。

1.3方法

1.3.1制备菌悬液复苏变形链球菌菌种，将其接种于BHI平板培养基上，37 ℃于厌氧条件下培养 24 h；用革兰染色法鉴定为变形链球菌后，挑取单菌落在培养液中进行扩增，24 h 后检测其密度,比浊法测定浊度，调密度至1×108CFU·mL-1,再通过培养液将菌悬液密度稀释至 1×107CFU·mL-1。

1.3.2抑菌实验用无菌水将绿原酸配置为不同质量浓度的溶液，根据文献中[5]绿原酸对于不同菌种的最小抑菌浓度设计浓度梯度为 0.5、0.625、1.0、 1.25、2.0、2.5、4.0、5.0 mg·mL-1。将灭菌干燥后的无菌滤纸片浸泡于不同浓度的溶液中，用无菌镊子取出浸泡后的纸片，沥干，贴于均匀涂布有变形链球菌的平板上，每个平皿贴 5 片，并设置阳性对照组(氯己定漱液)、 阴性对照组(无菌水)。每片纸片间隔距离≥24 mm，纸片中央与平皿边沿间隔距离≥15 mm。贴好纸片后，置平板于37 ℃恒温箱中培养，24 h后取出，用卡尺精确测量，记录纸片周围抑菌圈大小。重复实验3次，取平均值。以上实验操作均在超净工作台中进行。

1.4统计学处理数据采用SPSS 22.0软件进行分析, 选用单因素方差分析的Dunnett T3 检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同浓度绿原酸对变形链球菌生长的影响绿原酸浓度为0.5 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1、5.0 mg·mL-1的溶液对变形链球菌的抑菌圈直径均与阴性对照组差异有统计学意义。其中溶度为0.625 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1的绿原酸溶液对变形链球菌的抑菌圈直径,与阴性对照组差异有统计学意义，与阳性对照组差异无统计学意义(见表1)。

表1 绿原酸抑制变形链球菌的抑菌圈直径

3 讨 论

绿原酸(Chlorogenic acid)即3-咖啡酰宁酸，广泛分布于植物界中，其作为金银花中的主要功能性有机酸，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、降血脂等多种效用。 金银花(Flos Lonicerae)是一种常用的中药材，目前已被用来开发多种治疗呼吸道感染、肺炎、风疹的药物，如银翘解毒片、双黄连制剂等[6]。

柴贝贝等研究表明，绿原酸在与抗菌药联用后，大部分能增强鱼源链球菌对抗菌药的敏感性[7]；陈昶等研究发现绿原酸能够抑制变形链球菌的糖基转移酶活性，降低其对蔗糖的黏附能力[8]。同时，有研究表明，绿原酸能够破坏大肠杆菌的细胞膜和细胞壁，对引起龋病的变形链球菌、放线粘杆菌及引起牙周病的产黑色素类杆菌、牙龈炎杆菌、伴放线嗜血菌等均显示较强的抑菌活性[5]。还有研究者将绿原酸作为防腐剂添加至化妆品中，发现在膏霜内加入一定量的金银花叶提取物，在未添加其他任何防腐剂的条件下， 能够在半年内有效地抑制细菌生长，因此证明金银花叶提取物具有防腐抗菌的作用[9]。

本实验采用滤纸片法，测定变形链球菌在不同浓度绿原酸溶液作用下的抑菌圈大小。从测得的结果来看，绿原酸溶液浓度为5.0 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、1.25 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.625 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1时，对变形链球菌均能够产生抑制作用。氯己定作为临床常用的漱口水制剂，具有抗菌消炎的作用，本实验中浓度为0.625 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1的绿原酸溶液，其抑菌效果与氯己定比较无统计学差异。

绿原酸作为一种天然药物，不良反应较少，口感醇和，长期使用氯己定等漱口液制剂导致的味觉改变等症状[10]，在使用绿原酸时均能够避免。因此，本实验通过研究绿原酸对变形链球菌的抑菌作用，希望将其作为一种新型漱口水的主要成分，应用于人们的日常生活中，用于现代各种口腔疾病(龋病、牙周病等)的预防。