CLDN10基因检测在甲状腺癌诊疗的相关性研究及应用

俞科 黄婷 刘异 俞俊锋 吴晓芳

近年来我国甲状腺癌的发病率逐渐升高，尤其是甲状腺乳头状癌是近10年7种增长较快的恶性肿瘤之一。美国甲状腺学会推荐，甲状腺细针穿刺活检术（FNAB）是目前鉴别良恶性结节的金标准。CLDN10是高迁移率族蛋白家族中的一员，是小分子非组蛋白染色体蛋白，有CLDN10基因编码，CLDN10蛋白在胚胎发育过程中高表达，而在已经发育成熟的组织或分化组织中低表达或无法检测，CLDN蛋白自身无转录活性，作为转录调控蛋白，通过结合DNA和修饰染色质构型来影响细胞功能活性［1］。越来越多证据证实CLDN10与癌症发生发展相关。CLDN10可能通过靶向调节一些细胞周期相关的基因促进肿瘤细胞增殖。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年7月至2018年5月期间随机收集杭州市余杭区中医院50例甲状腺结节患者、50例甲状腺癌与50例健康人，年龄32～71岁，男83例，其中健康人25例，甲状腺良性肿瘤患者24例，甲状腺癌患者23例；女67例，其中健康人25例，甲状腺良性肿瘤患者26例，甲状腺癌患者16例。健康人群从体检人群中告知抽选，本研究获得了本院伦理委员会批准。

1.2 RNA提取步骤 （1）取米粒大小的组织，液氮研磨；（2）将研磨好的组织粉末加到1ml的trizol中，用移液枪上下吹吸数次；（3）加200μl氯仿，涡旋混匀，4℃，13000r/min离心15min；（4）缓慢取出，用移液枪小心吸取上清液于另一新的EP管中，注意不要吸到中间层；（5）吸出来的上清液中加入等体积的异丙醇，缓慢上下颠倒混匀，然后放至-20℃冰箱中30min；（6）取出后，4℃，13000r/min离心10min；（7）去掉上清液，加入75%乙醇洗涤，4℃，13000r/min离心10min；（8）离心后去掉上清液，室温下干燥5～10min，加入30～50μl RNase freeH2O，测浓度，于-80℃保存。

1.3 cDNA合成（逆转录反应） （1）配置逆转录反应液试剂为TOYOBO公司的Rever Tre Ace qPCR RT Kit试剂盒。第一步：试剂1；反应程序：反转录条件：65℃，5min；冰浴 2min。第二步：试剂2；反应程序：反转录条件：37℃，50min；98℃，5min；反应完成后，放4℃备用。（2）SYBR QPCR：仪器：PCR仪 ABI 7500；试剂：TaKaRa SYBRR Premix Ex Taq TM Ⅱ（Perfect Real Time）DRR081， 取2μl DNA加 至23μlReal Time PCR 反应体系中，总共25μl体系，反应条件：93℃3min，93℃30s；55℃45s；72℃45s 40循环，收集溶解曲线。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0软件分析。计数资料采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 采用ELISA法检测CLDN10蛋白在不同甲状腺组织中的表达结果癌症组、良性结节组、正常组均采用 ELISA法检测CLDN10蛋白在不同甲状腺组织中表达结果，CLDN10蛋白阳性率（n）在三组中分别为癌症组40，良性结节组为0.06，正常组为0.04。三组中癌症组阳性率最高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 甲状腺癌组织中CLDN10基因mRNA转录及其蛋白表达相关性分析 见表1。

表1 甲状腺癌组织中CLDN10基因mRNA转录及其蛋白表达相关性

2.3 甲状腺癌组织中CLDN10基因表达与临床相关性分析 见表2。

表2 甲状腺癌组织中CLDN10基因表达与临床相关性分析（n）

2.4 甲状腺癌患者单因素及多因素生存分析 见表3。

表3 甲状腺癌患者单因素及多因素生存分析

3 讨论

高迁移率蛋白（CLDN）A2蛋白是一种非组蛋白染色体蛋白，其能通过与染色质结合而改变染色质的结构，或直接与相关蛋白发生作用，继而调节其他基因的转录，进而影响肿瘤等发生。CLDN10在大多数肿瘤中均有高度表达，如甲状腺癌、结肠癌［2］、肺癌［3］和胃癌［4］等，而在正常组织中均不表达。本研究探讨CLDN10基因的表达水平与甲状腺结节和甲状腺癌的发生、发展的关联性，对甲状腺结节和甲状腺癌的诊断、预防和临床治疗提供帮助。

本研究采用ELISA法及real time-PCR检测对甲状腺癌患者、甲状腺良性结节患者以及健康人的CLDN10基因进行采集并进行分析，得出甲状腺癌患者的CLDN10表达阳性率明显高于甲状腺良性结节和健康人两组，提示CLDN10基因在甲状腺癌中高度表达。CLDN10目前已被公认为是一种新的癌基因，认为其在肿瘤的发生、发展中的作用可能与参与调节肿瘤相关基因的转录以及破坏DNA修复系统等相关［5］。Olson等［6］表明CLDN10可能通过pRB途径直接活化E2F1的活性，从而促进肿瘤细胞异常增殖。

本研究对甲状腺乳头状癌患者预后进行单因素生存分析发现CLDN10、肿瘤大小、淋巴结转移、是否侵犯腺体是其危险因素，进一步多因素生存分析发现CLDN10、淋巴结转移、是否侵犯腺体是其独立预测因素，而肿瘤大小不再是其独立预测因素，提示CLDN10基因可促进甲状腺肿瘤的发展及淋巴结转移，可能因为CLDN10基因还通过靶向调节一些相关的基因从而促进肿瘤细胞的增殖和转移［7］。蔡菁［8］认为CLDN10蛋白表达水平较高常预示有远处转移或患者的生存时间较短。研究还发现CLDN10能够促进上皮细胞间质化（EMT），从而导致甲状腺肿瘤的侵袭和转移能力增强［9］。CLDN10还可以作为甲状腺癌患者预后判断的指标。Belge等［10］研究提示CLDN10检测在鉴别良、恶性甲状腺肿瘤方面的敏感度和特异度分别为95.9%和93.9%，这对于甲状腺肿瘤切除术中的冷冻切片病理学检查具有重要意义。

本研究发现CLDN10在甲状腺乳头状癌患者中显著表达，同时与肿瘤转移及腺体侵犯与否有关，是判断甲状腺癌患者预后的独立预测因子，对临床治疗指导及预后判断具有重要意义。