缺血性脑卒中患者不同时期肠道菌群的多样性分析*

南 燕，李 哲，郭钢花，丁巧方

(郑州大学第五附属医院康复医学科，郑州 450052)

缺血性脑卒中(ischemic stroke)在所有脑卒中发病率、病死率、复发率最高[1-2]，是人类疾病防治的重点和难点。近来有研究表明，肠道菌群紊乱与缺血性脑卒中之间存在一定联系，但具体机制仍不清楚[3-7]，且目前尚无对缺血性卒中不同时期肠道菌群的变化特点及其与肠道功能的相关研究。因此，本研究以缺血性卒中患者及健康对照者为研究对象，利用高通量测序平台对二者粪便标本进行定性分析，以明确缺血性脑卒中患者不同时期肠道菌群的变化，进而为脑卒中治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年2月至2018年5月期间于本院神经内科就诊的急性缺血性脑卒中患者15例(观察组)。选择同时期本院体检中心的健康者20例作为对照组。(1)观察组纳入标准：①诊断标准参照1995年第四次全国脑血管疾病学术会议制订的诊断标准，且经头颅 CT 、MRI或DWI等影像学检查诊断明确；②自愿加入并配合该研究，签署知情同意书；③年龄在40～70岁。(2)对照组纳入标准：①无器质性疾病及脑血管病相关病史，无家族史；②本研究所需的实验室常规检查(血、尿、粪便常规，肝肾功能、血脂)正常；③自愿加入并配合该研究，签署知情同意书；④年龄在40～70岁。(3)观察组排除标准：①既往或此次发病存在颅内出血、恶性肿瘤、炎症性肠病等消化系统相关疾病、其他严重威胁生命的重大疾病(如肝衰竭、肾衰竭、心脏衰竭、呼吸衰竭等)；②3个月内使用过任何抗生素、益生菌或益生元制剂。(4)对照组排除标准：除需满足观察组排除标准外，还需符合，①既往有脑血管疾病病史；②目前存在急性疾病或正在服用药物。

1.2方法

1.2.1治疗方法 所有患者均接受神经内科常规治疗，包括营养神经、活血化淤、改善微循环、降压降糖等药物治疗；所有患者均为低盐低脂饮食。

1.2.2标本采集 使用专用的粪便收集盒、粪菌DNA保存液收集、保存所有入选者的粪便标本，以尽量减少标本污染和DNA降解等。所有粪便样本均及时冻存于-80 ℃冰箱中储存。

1.2.3肠道菌群DNA提取、PCR扩增及基因测序 观察组和对照组的所有粪便标本均统一进行肠道菌群DNA提取、PCR扩增及利用Illumina MiSeq测序平台进行基因测序。

1.2.4生物学分析

1.2.4.1操作分类单元(OTUs) 获取及分类学分析 在97%相似度下利用Usearch算法，通过聚类操作，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTUs的代表序列，然后将所有优化序列比对至OTUs代表序列，选出与代表序列相似性在97%以上的序列，获得最终的OTUs代表序列。采用RDP classifier贝叶斯算法对最终OTUs代表序列在门、纲、目、科、属和种等各个分类水平进行分析，获得各标本的群落组成情况。对比数据库为Greengene(Release 13.5 http://greengenes.secondgenome.com/)。

1.2.4.2物种多样性分析 a-多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性，本研究选择最能反映物种丰富度和均匀度的香农指数(shannon指数)和辛普森指数(simpson指数)进行分析，然后通过Wilcoxon秩和检验进行指数组间差异检验。P<0.05代表差异有统计学意义。shannon指数越高说明样品中的物种越丰富；simpson指数越低，说明样品中的物种越丰富。

1.2.4.3物种差异分析 利用线性判别分析(LEfSe分析)进行多级物种差异判别分析，LEfSe一种用于发现高维生物标识和揭示基因组特征的软件。包括基因，代谢和分类，用于区别两个或两个以上生物条件(或者是类群)。

2 结 果

2.1两组对象基线资料比较 观察组中15例患者均提供了急性期的首个粪便标本，因2例患者拒绝再次提供样本，故有13例患者提供了恢复期的首个粪便标本，对照组中20例入选者均提供了体检当天的粪便标本。观察组患者和对照组的性别、年龄、体质量指数(BMI)等相关指标比较，见表1。

表1 两组对象基本信息比较

2.2观察组患者不同时期与对照组的肠道菌群多样性比较 观察组患者在急性期及恢复期的肠道菌群多样性较对照组均出现明显减少(P<0.05)，且观察恢复期较急性期肠道菌群多样性增加(P<0.05)，见图1。

a：P<0.05，与急性期比较；b：P<0.05，与恢复期比较

图1观察患者不同时期与对照组肠道菌群多样性变化比较

2.3观察组患者不同时期与对照组LEfSe多级物种差异判别分析 观察组患者在急性期、恢复期与对照组在门(Phylum)、纲(Class)、目(Order)、科(Family)、属(Genus)等不同分类学水平的LEfSe多级物种差异判别分析见图2、3。对照组的特征性菌群为拟杆菌类(Bacteroides)、柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)；观察组患者急性期的特征性菌群为普罗威登斯菌属(Providencia)、颤杆菌克属(Oscillibacter)，恢复期的特征性菌群为Providencia、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)。

图3 观察组患者恢复期与对照组不同分类学水平LEfSe分析

2.4观察组患者不同时期物种组成差异分析 观察组患者急性期与恢复期的物种组成差异分析见图4。采用Wilcoxon秩和检验，在属水平上未发现观察组患者急性期与恢复期之间存在明显统计学差异的物种。

图4 观察组患者不同时期物种组成差异分析

3 讨 论

近年来，随着微生物组学的发展，肠道菌群与多种疾病之间的关系成为近年来的研究热点[8-10]。诸多研究表明肠道菌群与中枢神经系统疾病如脑卒中、阿尔茨海默病、多发性硬化、帕金森病等之间存在关系[11]。脑卒中患者及脑卒中后抑郁患者的肠道菌群多样性及物种组成等方面均会发生变化。

3.1脑卒中对肠道菌群多样性及物种组成的影响 本研究发现，观察组患者中Faecalibacterium下降，Providencia、Oscillibacter、Ruminococcaceae增加。Faecalibacterium是一种可以产丁酸盐的抗炎性细菌，该菌在2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、卒中后抑郁等疾病中有下降的现象[12-14]。Providencia可引起消化道感染、泌尿道感染及其他肠道外感染，是引起医院感染的常见机会性致病菌，也是常见的耐药菌。缺血性脑卒中后增加的Ruminococcaceae可以使皮质醇增高，5-羟色胺表达上调，进而加重中枢神经系统损伤，有研究对肠道菌群的基因组学组成研究亦发现脑缺血患者的Ruminococcaceae明显增加[15]。Oscillibacter在卒中后抑郁患者中减少，同时该菌还与氧化三甲胺(TMAO)水平呈正相关[14，16]。总体来说，脑卒中发生后，肠道内部分有益菌减少，部分机会性致病菌增多，且会持续相当一段时间，神经系统损伤、卒中后抑郁、机会性致病菌感染可能与此有关。

3.2缺血性脑卒中不同时期的肠道菌群变化特点 缺血性脑卒中急性期与恢复期的肠道菌群在物种组成上虽无明显统计学差异，但通过多样性分析发现后者较前者的肠道菌群多样性有增加的趋势，这在一定程度上可以反映出缺血性脑卒中患者肠道功能在恢复。因此，本课题组推测随着各项综合治疗的进行及病程的自然进展，在患者的临床症状、功能障碍逐渐好转的情况下，患者的肠道菌群多样性、物种组成及肠道功能有恢复的可能性，但肠道菌群的恢复时间、程度及与患者临床症状好转之间的相关性等仍有待进一步研究。

缺血性脑卒中不同时期出现的肠道菌群变化可能是肠道菌群与中枢神经系统相互作用的结果。近年来，新提出的“菌群-肠-脑”轴概念是研究卒中与肠道菌群关系的前提假设[17]，目前认为肠道菌群与中枢神经系统之间可能通过神经内分泌系统、免疫系统、迷走神经3条途径相互作用[18-20]，这3种途径之间相互影响，相互作用，实现肠道菌群与中枢神经系统的交流。此外，肠道菌群还可直接或间接影响高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等脑卒中危险因素，从而对脑卒中的发生及预后产生影响[21-22]。PONFERRADA等[23]研究发现，大脑缺血作为一种应激，可导致细菌移位，同时，细菌移位会增加梗死面积，给卒中结局带来不良影响[24]，此外有研究表明粪菌移植可以明显改善卒中预后[25]，这些研究都说明缺血性脑卒中与肠道菌群之间存在相互影响。

通过本研究推测，正是由于上述复杂的作用机制，才形成了缺血性脑卒中不同时期肠道菌群的变化特点。随着缺血性脑卒中临床症状的好转及梗死灶的软化，肠道菌群亦有恢复的可能性，二者之间相辅相成，互相影响，这也印证了“菌群-肠-脑”轴存在的可能性。

本研究仍存在一些不足，未能对缺血性脑卒中更远期与肠道菌群的关系进行研究，需扩大样本量、延长观察时间，希望能够找出脑卒中时期具有代表性的肠道菌群，进而更具针对性的补充益生菌，为脑卒中的治疗提供新的靶点。