3种四逆汤抗脓毒症的药效学差异及急性毒性研究

1.昆明市中医医院，云南 昆明 650011；2云南中医药大学，云南 昆明 650000；3昆明市医学科学研究所，云南 昆明 650000

四逆汤是仲景名方，被誉为“回阳救逆第一方”。全方由附子、干姜、炙甘草三味药组成，是治疗少阴病阳虚阴盛证的主方，以阴盛阳衰，致四肢厥逆而命名;呕吐、下利清谷、四肢厥逆、表热里寒、下寒上热、真寒假热、脉沉微、沉迟、微细、脉微欲绝等，是本方的适应证。现代中医运用四逆汤治疗临床各科危重症，凡具有心肾阳虚病理特点者，均可用该方治疗，并取得了较好的临床效果[1-2]，笔者在长期的临床实践中发现，在四逆汤的临证运用中，对该经方中君药附子的用法和用量各家存在较大差异，《伤寒论》中四逆汤原方使用生附子入药，原著中四逆汤附子的用法为“一枚生用去皮破八片”，此“一枚”者，一般为10～15 g，在2010版《中国药典》中规定的四逆汤使用附片入药，剂量为“3～15 g”，以吴荣祖教授为代表的云南吴氏扶阳学术流派，经过长年的实践，积累了大量成熟运用四逆汤的临床经验，吴氏在组方上重用附子，采用附片入药，剂量可用到100 g。由于不同医家使用四逆汤时附子的用法和用量差异较大，在药效学及毒性上是否也存在差异，目前尚不清楚，因此，本研究根据四逆汤主治诸证之症状与现代临床脓毒症休克的症状较为相似的特点，且有多项临床及药理研究亦表明四逆汤具有抗多种休克的临床疗效[3-4]，本实验选择了小鼠脓毒症模型为研究对象，对《伤寒论》组成四逆汤(下称：伤寒四逆汤)、《中国药典》组成四逆汤(下称：药典四逆汤)以及吴荣祖教授经验组成四逆汤(下称：吴氏四逆汤)抗脓毒症的药效学进行了比较研究，并对3种四逆汤小鼠经口给药的急性毒性差异进行了比较，现将研究结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 试验药物 药典四逆汤(组成：附片15 g，干姜10 g，炙甘草15 g)，伤寒四逆汤(组成：生附子15 g,干姜23.4 g,炙甘草31.2 g)，吴氏四逆汤(组成：附片100 g，干姜20 g，炙甘草10 g)。

1.2 动物 昆明种健康小鼠160只，雌雄各半，体重量(20±2) g，SPF级，由辽宁长生生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2015-0001。

1.3 试剂 附片、干姜、炙甘草饮片均购自慈慧药业有限公司，生附子购自中国中药公司四川江油中坝附子科技发展有限公司，经昆明市中医医院马雁滔中药师鉴定为正品；小鼠TNF-α(批号：20170801)、IL-1β(批号：20170805)、IL-6(批号：20170804)ELISA试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；95%乙醇，购自天津市致远化学试剂有限公司。

1.4 仪器 台式微量高速离心机(日立工机株式会社，型号CF16RXⅡ);酶标仪(InfiniteM200PRO，瑞士Tecan公司)；超纯水系统(美国Millipore，型号ZMQS50F01)。

1.5 方法

1.5.1 3种四逆汤受试物的制备 按各组方十倍量称取附子，加8倍量蒸馏水煮沸1 h，称取干姜、炙甘草加入，同时加入8倍量蒸馏水共煎1 h。过滤，药渣加6倍量蒸馏水煮沸2 h。过滤，再次加6倍量蒸馏水煮沸1 h。合并3次滤液浓缩至相应体积(脓毒症模型所用各组方均按人和动物的体表面积换算为临床人用量的一倍量，根据临床药效量换算出小鼠用药典四逆汤剂量为5.2 g生药/k g，伤寒四逆汤剂量为9 g生药/kg，吴氏四逆汤为16.9 g生药/kg；急性毒性实验时将各方水煎液浓缩至能通过小鼠12号灌胃针头的最大浓度)。冷却至室温，4 ℃冰箱备用。

1.5.2 盲肠结扎穿孔致小鼠脓毒症模型的复制 昆明种小鼠80只，雌雄各半，随机分为4组：假手术组、药典四逆汤组、伤寒四逆汤组、吴氏四逆汤组。每组雌雄各10只。术前禁食不禁水12 h，参考文献方法[5]建立盲肠结扎穿孔致脓毒症小鼠模型，KM种小鼠以1%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉后腹部消毒备皮，无菌条件下沿腹部正中线作1 cm切口，找到盲肠，于盲肠根部至回盲瓣1/3处用4号手术缝合线结扎盲肠，用18号针穿刺盲肠2次，挤出少量肠内容物，随后将盲肠纳入腹腔，缝合手术切口，小鼠术后3 h腹部皮下注射25 mg/kg亚胺培南西司他丁钠作抗感染处理。假手术组小鼠除盲肠不结扎和穿刺外，其余操作与手术组相同。术后观察小鼠状态，记录小鼠存活情况。造模后一天开始灌胃给予相应的药物，假手术组和模型组给予蒸馏水，连续给予14 d。

1.5.3 炎症因子的测定 末次给药后2 h，各组小鼠眼底静脉丛取血约1 mL，静置2 h，3000 rpm离心10 min，取上清液按照试剂盒操作说明检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.5.4 肺、肝组织HE染色 所有动物脱颈椎处死，分离颈部，暴露气管，从气管中段剪口，用注射器将10%福尔马林溶液经气管灌入肺组织中，小心摘除心脏和其他附属组织，完整取出肺组织。剪开腹腔，取出肝脏组织。取出的组织立即投入盛有10%福尔马林溶液的固定瓶中浸泡固定。

1.5.4.1 肺组织病理制片 取左肺于常温下固定48 h后，清水漂洗组织块2 h后进依次放入为75%，86%，95%Ⅰ、Ⅱ的乙醇各30 min，100%Ⅰ、Ⅱ乙醇各20 min进行组织脱水，经二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min透明后，放入石蜡Ⅰ30 min，石蜡Ⅱ1 h，石蜡Ⅲ2 h浸蜡，然后石蜡包埋，制作成4 μm厚的切片。将切片放入65 ℃的烘箱中烘烤30 min，行HE染色。最后中性树胶封片，镜检。

1.5.4.2 肝组织病理制片 取肝右叶于常温下固定48 h后，清水漂洗组织块2 h后进行组织脱水。脱水条件如下：依次放入质量分数为75%，85%，95%Ⅰ、Ⅱ的乙醇各1 h，100%Ⅰ、Ⅱ乙醇各30 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，石蜡Ⅰ30 min，石蜡Ⅱ1 h，石蜡Ⅲ2 h，然后石蜡包埋，制作成4 μm的切片。余下步骤与上同。

1.5.5 急性毒性实验 经预实验，3种四逆汤水煎浓缩液在最大浓度、最大灌胃体积下小鼠灌胃，动物无死亡，故进行最大给药量的测定。取昆明种小鼠80只，雌雄各半，随机分为4组：正常组、药典四逆汤组、伤寒四逆汤组、吴氏四逆汤组。每组雌雄各10只。试验前禁食不禁水12 h，药典四逆汤组灌胃给药剂量为256 g/kg体重，伤寒四逆汤组灌胃给药剂量为125 g/kg体重，吴氏四逆汤组灌胃给药剂量为288 g/kg体重，假手术组给予等体积的生理盐水，给药体积为0.4 mL/10g。给药后连续观察14 d，每天观察各组动物的外观、行为和毒性行为，记录动物的体重、进食量。试验第14 d处死、解剖小鼠，观察其主要脏器的外观。

2 实验结果

2.1 3种四逆汤对脓毒症小鼠死亡率的影响 结果显示，假手术组全部存活，造模后少数动物出现死亡，解剖可见盲肠下端肠与腹壁粘连。3种四逆汤对小鼠盲肠结扎穿孔法致脓毒症模型具有生存保护作用，可降低小鼠死亡率。各组动物死亡情况见表1。

表1 3种四逆汤对脓毒症小鼠死亡率的影响 (n=20)

注：死亡率(%)=死亡数/(死亡数+存活数)。

2.2 3种四逆汤对脓毒症小鼠血清炎症因子的影响 结果显示，小鼠盲肠结扎穿孔法致脓毒症模型建立后，血清中炎症因子明显增高；给予3种四逆汤干预后，吴氏四逆汤可明显减少模型动物血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，药典四逆汤可明显减少血清中炎症因子TNF-α、IL-1β的含量，伤寒四逆汤仅可明显减少炎症因子TNF-α的含量结果见表2、图1。

表2 3种四逆汤对脓毒症小鼠血清炎症因子的影响

注：与正常组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01。

2.3 3种四逆汤对脓毒症小鼠肺组织损伤的影响

假手术组显示肺组织结构正常，肺泡腔干净。模型组小鼠肺组织内均可见肺泡壁内、肺泡腔内细胞增多，主要为肺泡巨噬细胞和淋巴细胞增多，肺泡壁明显增厚，炎症明显。药典四逆汤组、伤寒四逆汤组、吴氏四逆汤组细胞增生情况较模型组减轻，见图2。

各组肺切片均可见少量的肺泡内出血现象，各组之间在出血量、出血部位等方面均无明显差异，考虑此肺泡内出血与颈椎脱臼处死方式有关，颈椎脱臼可使颈部气管受损，从而出血，血液自然下流或气管内注射固定液均可将血液带入肺泡腔内。

2.4 3种四逆汤对脓毒症小鼠肝脏损伤的影响 假手术组显示肝组织结构正常，肝索排列规则，汇管区干净。模型组炎性细胞浸润明显，有多个散在的肝细胞小灶性的变性坏死。药典四逆汤组、伤寒四逆汤组、吴氏四逆汤组肝细胞形态基本正常，肝细胞变性较轻，有轻微的炎性浸润，偶见点状坏死，见图3。

2.5 3种四逆汤经口给予小鼠的急性毒性的影响 结果显示，给药后14 d内，药典四逆汤组和吴氏四逆汤组动物未见死亡，一般状况良好，饮食、二便正常，且外观、皮毛、行为、呼吸均正常，鼻、眼、口腔无异常分泌物，未见其它明显异常反应。各给药组与正常组的体重增长变化趋势基本一致，进食量随体重的增长而增加。伤寒四逆汤组动物在给药12 h内有些微腹泻情况，第3天即恢复正常，但未见死亡。试验结束后观察各组主要脏器无明显异常，表明3种四逆汤在常规剂量下使用是安全的。小鼠单次给药的最大给药量：吴荣祖教授经验方四逆汤(288 g生药/kg)>《中国药典》收录四逆汤(256 g生药/kg)>《伤寒论》记载四逆汤(125 g生药/kg)。

5 讨论

四逆汤是温补心肾，通脉止痛的代表方，临床应用广泛，可治疗多种休克、冠心病、心绞痛等疾病，均具有显著疗效。现代药理学研究表明该方具有强心、抗休克、抗心肌缺血、调节免疫功能等作用。该方应用虽广，但各家用四逆汤时附子的用法和用量差异较大，而药效学及毒性是否有差异尚不清楚，需深入探究附子的用法和用量对该方作用影响，为临床安全有效用药提供理论依据。

脓毒症是一种严重的临床疾病，是由感染引起的全身炎症反应综合征，在过去30年中，尽管最新研究表明抗生素治疗和重症监护取得了进展[6]，但其病死率仍高达30%～50%，已成为住院和医疗费用的主要原因之一[7]，探索规范和有效的治疗手段和药物，实属当务之急，也无疑具有重要的理论价值及临床意义。从症状学的角度来看，《伤寒论》中四逆汤诸证与脓毒症的临床症状十分相似，而多项临床及药理研究亦表明，四逆汤对各类休克具有一定的治疗作用，但以往开展的与其作用机制相关的药理研究主要集中于强心和改善微循环等方面，均不能很好解释其回阳救逆功效的内涵。近年来的研究表明，细胞因子激活是宿主对感染的防御反应的一部分，但过度分泌和分泌细胞因子会引起广泛的组织损伤和器官衰竭[8]。TNF-α和IL-6参与了脓毒症引起的组织损伤，被认为是脓毒症或脓毒性休克等严重炎症疾病的主要调节因子[8-9]。IL-1β是脓毒症时促炎反应的主要炎症因子[10]，可以直接反映动物机体受损的严重程度。在本实验中，3种四逆汤对小鼠盲肠结扎穿孔法致脓毒症模型具有生存保护作用，降低小鼠死亡率。同时，3种四逆汤均可不同程度降低小鼠脓毒症模型血清中炎症因子TNF-α，IL-1β，IL-6的水平，抑制炎症反应。吴荣祖教授经验方四逆汤重用附子，在本实验研究中显示其对TNF-α，IL-1β，IL-6三个炎症因子均显示了明显的抑制作用，其中以抑制炎症因子TNF-α的作用更为明显。

为进一步比较3种四逆汤急性毒性的差异，本实验对小鼠进行了经口给药的急性毒性实验研究。在最大浓度、最大灌胃体积下给予小鼠灌胃，小鼠未出现死亡及明显毒性反应，故测定其经口给药的最大给药量。给药后小鼠一般状况良好，饮食、二便均正常，无异常分泌物。小鼠单次给药的最大给药量：吴荣祖教授经验方四逆汤(288 g生药/kg)>《中国药典》收录四逆汤(256 g生药/kg)>《伤寒论》记载四逆汤(125 g生药/kg)，吴氏四逆汤小鼠经口给药的最大给药量为临床成人用量的155倍，提示临床用药是安全的。

通过本实验的研究，提示，四逆汤中附子的用法和用量的不同在药效学及安全性方面可产生一定的差异，但由于本实验在药效学方面仅对脓毒症模型进行了考察，在四逆汤的其它药效学方面的差异尚需进行大量深入系统的比较研究。