表皮生长因子对抗NMDA受体脑炎致海马神经元损伤的保护作用

李振宏

[摘要] 目的 研究表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）干预治疗抗NMDA受体脑炎诱导的神经元损伤的保护作用及机制，为抗NMDA受体脑炎提供新的治疗靶点。 方法 建立抗NMDA受体脑炎诱导的神经元损伤模型，当神经元细胞培养至第8天，将实验组分为1﹑2 d和3 d 3个时相点， 每个时相点15个标本，在实验组中加入EGF（10 ng/mL），应用台盼蓝染色法、免疫组织化学和TUNEL细胞凋亡检测等技术， 检测EGF对抗NMDA受体脑炎诱导神经元损伤的保护作用以及细胞凋亡基因caspase-3表达水平变化。 结果 当谷氨酸浓度为100﹑200 μmol/L时，细胞凋亡率高[（2.2 ±1.014）%、（3.3±0.975）%]，而细胞存活率并不低[（77.6±5.039）%、（73.4±4.969）%];在诱导神经元凋亡实验中，凋亡后3 d内，3组细胞的神经元细胞存活率相互比较，差异有统计学意义（P<0.05）;3组细胞的神经元凋亡率相互比较，差异有统计学意义（P<0.05）;3组细胞的caspase-3基因阳性表达率相互比较，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论EGF对抗NMDA受体脑炎导致的神经元损伤有保护作用，可能是EGF通过促使凋亡基因caspase-3表达减少，抑制神经元凋亡发生，从而对抗NMDA受体脑炎诱导的神经元损伤起到保护作用。

[关键词] 抗NMDA受体脑炎;神经元;损伤;表皮生长因子

[中图分类号] R742 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2019）02（b）-0047-05

Protective Effect of Epidermal Growth Factor on Hippocampal Neuronal Injury Induced by NMDA Receptor Encephalitis

LI Zhen-hong

Department of Pediatrics， Ganzhou Hospital Affiliated to Nanchang University， Ganzhou， Jiangxi Province， 341000 China

[Abstract] Objective To study the protective effect and mechanism of epidermal growth factor （EGF） intervention on anti-NMDA receptor encephalitis-induced neuronal injury， and provide a new therapeutic target for anti-NMDA receptor encephalitis. Methods A neuronal injury model induced by anti-NMDA receptor encephalitis was established. When the neuron cells were cultured until day 8， the experimental components were divided into three phases， one day， two days and three days， each phase point 15 samples. In the experimental group， EGF（10 ng/mL） was added to the experimental group， and the protective effect of EGF against NMDA receptor encephalitis-induced neuronal injury was detected by trypan blue staining， immunohistochemistry and TUNEL apoptosis detection. And the expression level of the apoptosis gene caspase-3 was changed. Results When the concentration of glutamic acid was 100， 200 μmol / L， the apoptotic rate was high [（2.2± 1.014）%，（3.3±0.975）%]， while the cell survival rate was not low [（77.6±5.039）%，（73.4±4.969）%]; in the induction of neurons of the apoptosis experiment， the neuronal cell survival rates of the three groups were compared within 3 days after apoptosis， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The neuronal apoptosis rates of the three groups were compared with each other. the difference was statistically significant（P<0.05）. The positive expression rates of caspase-3 gene in the three groups were compared with each other， and the statistical the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion EGF has a protective effect against neuronal damage caused by NMDA receptor encephalitis. It may be that EGF inhibits neuronal apoptosis and playing a protective role in inhibiting the expression of caspase-3 and inhibiting neuronal damage induced by NMDA receptor encephalitis.

[Key words] Anti-NMDA receptor encephalitis; Neurons; Injury; Epidermal growth factor

抗N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA） 受体脑炎是一种起病时临床表现不典型，易被临床工作者忽视的一种神经系统疾病[1]。表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）是Cohen[2]于1962年发现的一种可促进人体细胞生长的营养因子，由多个氨基酸编码组成，在正常人体内表皮生长因子含量较少。随着医学生物技术的不断提高，现在国内外已能大量生产人表皮生长因子。该研究针对抗NMDA受体脑炎的发病机制，通过建立抗NMDA受体脑炎体外培养模型， 当神经元细胞培养至第8天，将实验组分为1﹑2 d和3 d 3个时相点， 每个时相点15个标本，观察EGF对抗NMDA受体脑炎诱导神经元损伤的保护作用，了解EGF对神经元的作用和机制， 为抗NMDA受体脑炎的临床研究提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择刚出生的SD大鼠培养原代神经元细胞， 把原代神经元细胞分3组（实验组﹑对照组和正常组），每组分1﹑2 d和3 d 3个时相点， 每个时相点15个标本。

1.2 方法

1.2.1 原代神经元培养 选择刚出生的SD大鼠，用眼科镊取出海马，D-Hanks液清洗后，剪成1 mm3左右的小块，在37℃温度下用0.25%胰蛋白酶消化组织小块后， 调节细胞悬液浓度为1×106/mL， 接种于经0.01%多聚赖氨酸预处理的细胞培养瓶中。在神经元培养第9天， 经过神经微丝-200免疫组织化学法鉴定， 神经元细胞占培养细胞的90%以上。

1.2.2 建立抗NMDA受体脑炎诱导的神经元损伤模型当神经元细胞培养至第9天，将神经元分为谷氨酸实验组及正常对照组，谷氨酸浓度分别为100 、200 、300 、400 μmol/ L 。正常对照组不加入任何药品处理，实验组中不同浓度的谷氨酸与神经元细胞作用15 min后更换新鲜培养液， 24 h后进行台盼蓝染色和TUNEL细胞凋亡检测。

1.2.3 台盼蓝染色检测细胞存活率神经元细胞 经台盼蓝法染色后，随机选取15个视野，计数蓝染神经元数，死亡细胞被染成蓝色， 未着色的细胞为存活細胞。神经元存活率（%）=（实验组神经元存活数/细胞总数） ×100%。

1.2.4 TUNEL检测细胞凋亡率 神经元细胞经TUNEL检测，随机选取15个视野，计数深棕色神经元数，凋亡细胞被染成深棕色， 未着色的细胞为存活细胞。神经元凋亡率（%）= （实验组神经元凋亡数/细胞总数） ×100%。

1.2.5 凋亡基因Caspase-3表达检测 采用免疫组织化学方法，随机选取15个视野，计数阳性神经元数和总神经元数， 阳性神经元为细胞中有棕色着色者， 凋亡基因caspase-3阳性表达率（%）= （阳性神经元数/神经元总数） ×100%。

1.2.6 EGF对抗NMDA受体脑炎诱导神经元损伤的保护作用 把神经元分为实验组﹑对照组和正常组共3组，每组分1﹑2 d和3 d三个时相点， 每个时相点15个标本。实验组在加谷氨酸前1天加入EGF （10 ng/mL）， 对照组中加入相同剂量缓冲液， 正常组不作处理。

当神经元细胞培养至第9天， 将低浓度谷氨酸（100 μmol/L）加入实验组和对照组中，15 min后换回正常细胞培养液， 正常组不加入谷氨酸。继续培养细胞至1﹑2 d和3 d进行细胞存活率、凋亡率和凋亡基因检测。

1.2.7 统计方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行3组细胞数据分析，以均数±标准差（x±s）表示计量资料， 两组间进行t检验分析，多组间比较采用方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）

2 结果

2.1 神经元细胞培养及鉴定神经元接种

在细胞培养瓶后，可见神经元为悬浮在始建于培养液中的圆形细胞，， 细胞密度很高。1 d后在培养瓶壁上可见大多数神经元基本贴壁， 少数神经元可见轴突生长， 轴突长度约占细胞体的一半， 2 d后大多数神经元有轴突生长，长度约为胞体的2～3倍，3 d后神经元细胞胞体变大，轴突长度增长不明显， 第4～5天可见许多细胞碎片，为崩解的神经胶质细胞， 培养第8天，轴突逐渐增长， 彼此相互连接， 形成网状（照片1）。

细胞培养第9天， 免疫组织化学鉴定神经元， 神经元细胞及其轴突被染成棕色，棕色阳性细胞占全部细胞的90%以上（照片2）。

2.2 抗NMDA受体脑炎诱导的神经元损伤模型

2.2.1 细胞存活率 比较不同浓度的谷氨酸作用于神经元细胞6 h后，可见部分细胞胞体肿胀，细胞轴突变短;1 d后部分肿胀细胞裂解。采用台盼蓝染色法计算神经元存活率，结果发现各种浓度的谷氨酸都能诱导神经元细胞死亡，各种浓度的谷氨酸组神经元细胞与对照组神经元细胞比较，差异有统计学意义（P<0.01） ，而且随着实验组谷氨酸浓度逐渐升高，神经元细胞的存活率也逐渐下降（照片3）。

2.2.2 细胞凋亡率 比较TUNEL染色发现，不同浓度的谷氨酸作用于神经元细胞1 d后，神经元细胞体积变小，细胞核固缩。各种浓度的谷氨酸都能诱导神经元凋亡，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），在谷氨酸浓度为100﹑200 μmol/ L时，神经元凋亡率随着谷氨酸浓度的升高而上升，在谷氨酸浓度为200﹑300﹑400 μmol/ L时，细胞凋亡率随着浓度的上升而下降（照片4）。相关数据见表1、图1、图2。

2.3 EGF对神经元的保护作用

2.3.1 细胞凋亡检测 在神经元细胞培养第9天，使用100 μmol/L谷氨酸诱导神经元凋亡后，通过TUNE方法检测， 结果显示：凋亡后第1天， 正常组的神经元凋亡率为0.8%， 较实验组细胞（1.4%）和对照组细胞（2%）明显下调，差异有统计学意义（P<0.05）;实验组细胞与对照组细胞比较， 统计学比较差异有统计学意义（P<0.05）。细胞凋亡后第2天，正常组的神经元凋亡率为1.1%，较实验组细胞（2.2%）和对照组细胞（5.4%）明显下调， 差异有统计学意义（P<0.05）;实验组细胞与对照组细胞统计学比较，差异有非常显著性意义（P<0.01）。凋亡后第3天，正常组的神经元凋亡率为1.4%，较实验组（3.5%）和对照组（6.2%）明显减少， 差异有统计学意义（P<0.01）;实验组细胞与对照组细胞比较，差异有统计学意义（P<0.01）（照片5）相关数据见表2、图3。

2.3.2 神经元存活率检测 在谷氨酸诱导神经元凋亡后的1﹑2 d和3 d，使用行台盼蓝方法染色， 结果显示：凋亡后1 d， 正常组的神经元存活率为90.2%，较实验组（90.2%）和对照组（75.9%）明显增加， 差异有统计学意义（P<0.01）;与对照组细胞比较， 实验组细胞存活率明显上调，差异有统计学意义（P<0.01）。凋亡后第48 h， 正常组的细胞存活率为84.4%，较实验组（75.3%）和对照组（70.5%）明顯增加， 差异有统计学意义（P<0.01）;与对照组细胞比较， 实验组细胞存活率明显增上调，差异有统计学意义（P<0.05）。凋亡后72 h， 正常组的细胞存活率为81.4%，较实验组（72.3%）和对照组（66.6%）明显增加， 差异有统计学意义（P<0.01）;与对照组比较， 实验组存活细胞明显增加， 差异有统计学意义（P<0.05）。存着数据见表3、图4。

2.3.3 凋亡基因Caspase-3表达情况 通过免疫组化技术，检测凋亡基因caspase-3在神经元中的表达情况，神经元胞浆和轴突着色的为caspase-3阳性细胞。凋亡后第1天， 正常组的caspase-3阳性细胞率为1.3%， 较实验组（3.6%）和对照组（6.9%）明显减少， 差异有统计学意义（P<0.01）;与对照组比较， 实验组caspase-3阳性细胞明显减少， 差异有统计学意义（P<0.01）。凋亡后第2天， 正常组的caspase-3阳性细胞率为2.7%， 较实验组（5.4%）和对照组（12.2%）明显减少， 差异有统计学意义（P<0.01）;与对照组比较， 实验组caspase-3阳性细胞明显减少， 差异有统计学意义（P<0.01）。凋亡后第3天， 正常组的caspase-3阳性细胞率为3.9%， 较实验组（8.2%）和对照组（13.2%）明显减少， 差异有统计学意义（P<0.01）;与对照组比较， 实验组caspase-3阳性细胞明显减少， 差异有统计学意义（P<0.01）（照片6），具体数据见表4。

3 讨论

抗N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA） 受体脑炎是一种起病时临床表现不典型，易被临床工作者忽视的一种神经系统疾病，主要累及人体大脑边缘系统，典型临床表现以精神异常与癫痫发作为特征，其中大多数患者由肿瘤、感染[1]等引起。目前国内外学者大多数认为该病是抗NMDA抗体介导的免疫损伤所致[3-4]。其中NMDA受体是一种谷氨酸离子型受体，是由多种亚基组成的异四聚体，属电压门控通道，大量存在于大脑神经细胞中，其中主要分布在大脑海马区等边缘系统，功能主要是调节突触传递及促发突触重塑，异常激活常导致惊厥发作、精神异常等临床表现[5-6]。

我们在神经元细胞培养至第10天，当神经元发育成熟，细胞状态良好时，用不同浓度的谷氨酸作用于神经元细胞。通过TUNEL和细胞存活率检测，结果表明谷氨酸可使细胞死亡率明显升高，并且随着谷氨酸浓度的升高而升高;谷氨酸浓度为100﹑200 μmol/ L时，细胞凋亡率随着谷氨酸浓度的升高而升高，而浓度为200﹑300﹑400 μmol/ L时，细胞凋亡率随着谷氨酸浓度的升高而下降。由于谷氨酸浓度为100﹑200 μmol/ L时，细胞凋亡率高而细胞死亡率并不高，提示100﹑200 μmol/ L的谷氨酸为诱导神经元凋亡的最合适浓度。我们在使用谷氨酸诱导神经元凋亡的前1 d，在实验组神经元中加入EGF，然后采用TUNEL检测和台盼蓝染色等方法来评价EGF对神经元的保护作用。该次的研究结果表明，加入了EGF的实验组细胞存活率明显高于对照组，而细胞凋亡率却明显低于对照组，提示EGF对抗NMDA受体脑炎导致的神经元损伤具有抑制作用，对神经元具有保护作用。而其对神经元的保护作用，可能主要是通过抑制凋亡的途径来实现的。

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用， 其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥作用。caspase-3 正常以酶原的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，活化的caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡[7-8]。在抗NMDA受体脑炎导致的神经元凋亡的机制中，有无caspase-3的参与，而EGF对其表达有无抑制作用， 为此我们作了caspase-3免疫组化[9-12]。

结果显示：谷氨酸损伤使caspase-3蛋白表达增加，提示caspase-3参与了抗NMDA受体脑炎导致的神经元凋亡的机制; 实验组的caspase-3蛋白表达比对照组明显减少，并且与细胞凋亡呈高度正相关，提示EGF可抑制caspase-3蛋白表达，因此其抑制凋亡的作用可能与抑制caspase-3蛋白表达有关。

中國全科医学杂志发表的文章《碱性成纤维细胞生长因子对癫痫致诲马神经元损伤的保护作用》也做过类似的实验，采用50 μmol/L的谷氨酸诱导神经元凋亡，在实验组中加入碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，20 ng/mL），观察bFGF对损伤神经元存活的保护作用以及caspase-3基因在损伤神经元中的表达情况。在诱导神经元凋亡1 d后，实验组的细胞存活率（83.8±6.8）%与对照组比较（77.4±6.5）%比较，差异有统计学意义（P< 0.05）;实验组的细胞凋亡率（1.5±0.7）与对照组比较（2.7±1.4）%比较，差异有统计学意义（P<0.05）;实验组的caspase-3基因阳性表达率（3.8±1.8）与对照组比较（6.2±3.0）%比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与该实验不同的是，该实验采用的是浓度为100 μmol/ L的谷氨酸诱导神经元凋亡，诱导神经元凋亡后加入的是EGF，但说明了EGF对损伤神经元也具有保护作用，以及其抑制凋亡的作用可能与抑制caspase-3蛋白表达有关。

综上所述，该研究提示100μmol/ L谷氨酸可作为抗NMDA受体脑炎导致的神经元凋亡的良好模型， EGF对抗NMDA受体脑炎导致的神经元损伤有保护作用， 可能是EGF通过促使凋亡基因caspase-3表达减少，抑制神经元凋亡发生从而对抗NMDA受体脑炎诱导的神经元损伤起到保护作用。

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（收稿日期：2018-11-15）