不同支气管镜介导标本的TB-DNA检测对痰涂片阴性肺结核患者的诊断价值研究*

宋 健 邓爱兵 李 杨 毛建军 王 姜 张 帅 李真真 徐 锋* 刘海燕

目前，肺结核的诊断主要依靠胸影像学、临床症状及实验室检查综合判断，确诊往往需痰液检查到抗酸杆菌或痰抗酸杆菌培养阳性，但由于临床症状及影像学表现不典型，加上由于化疗、免疫功能障碍，结核杆菌的某些生物学特性发生变异，常规涂片检查往往不易发现结核杆菌[3-4]。同时，痰菌含量少或呈L型结核菌、肺部病灶局限未与引流支气管相通等因素，均可致使痰涂片检查阴性[5]。由于气管镜可直观肺部病变部位，并在病变部位直接取材(目前常用肺泡灌洗术取材)，极大提高了标本诊断阳性率，但其检出率仍有待提高。采用气管镜毛刷刷检送检结核分枝杆菌基因(tuberculosis DNA，TB-DNA)的检测方法国内尚未见报道。为明确针对肺结核患者诊断价值最高的检测方案，本研究选取对痰涂片阴性结果的肺结核患者，采取不同取材方式对其进行诊断分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选取2016年10月至2018年4月沧州市人民医院收治的234例痰涂片阴性肺结核患者，其中男性121例，女性113例；年龄16～67岁，平均年龄(38.15±5.24)岁；病程0.5～10个月，病程中位数3.6个月；220例患者存在咳嗽、咳痰及咯血等症状；63例患者存在不同程度的发热；38例患者存在明显的胸闷、气促症状；136例患者X射线平片表现为密度不均匀的斑片状低密度影、钙化及空洞；单纯表现为阻塞性肺炎41例；肺不张56例；17例患者存在结节、软组织肿块影；9例患者存在局限性肺气肿；3例患者具有两肺弥漫栗粒影。对所有患者行胸部CT检查时发现：49例患者表现出斑块状浸润影改变；67例患者具有支气管扩张表现；9例患者检出有局限性肺气肿，且明显可见局部支气管狭窄。所有受检者均用肺泡灌洗和毛刷刷检收集痰液标本后行荧光定量PCR检测TB-DNA。患者对检测方案知情同意，并签署同意书，本研究经过医院伦理委员会审核。

1.2 纳入与排除标准

(1)纳入标准：①所有研究对象在入院后均存在不同程度的发热、乏力、消瘦及呼吸困难等临床表现，临床表现结合多项影像学与实验室检查判定为疑似肺结核；②纳入患者有纤维支气管镜及肺泡灌洗术和刷检适应证；③痰涂片结核杆菌检测为阴性结果。

(2)排除标准：①合并有多项重要器官功能障碍者；②孕妇、免疫抑制者；③有纤维支气管镜及肺泡灌洗术和毛刷刷检禁忌证者；④严重肺动脉高压；⑤本次研究检查前1个月采用抗凝药物进行治疗；⑥支气管肺活动性出血。

1.3 仪器设备

采用ET 260型电子支气管镜(日本OLYMPUS公司)。

1.4 检查方法

1.4.1 支气管镜检查方法

采用ET 260型电子支气管镜(插入部外径4.9 mm，工作孔道2.2 mm)对患者进行支气管镜的检查，检查方式参考《诊断性可弯曲支气管镜应用指南(2008年版)》[6]相关操作标准规范执行，检查前参考血常规、凝血功能以及心电图等常规检查结果，对患者病情进行综合评估。采用2%利多卡因进行麻醉处理后在电子支气管镜的辅助下对患者各段支气管进行详细检查。参考胸部CT检测结果对主要病变区域采用保护性套管黏膜刷刷检，经钳孔将黏膜刷插入至病变部位，稍加压力旋转刷擦3次，取出黏膜刷待检。行支气管肺泡灌洗处理，支气管肺泡灌洗方法为：首先通过对患者胸部CT检查图像进行详细分析，明确主要病变区域作为灌洗区域，后将支气管镜末端插入支气管开口部位，选用0.9%氯化钠注射液(NaCl)50 ml作为灌洗液，将灌洗液温度控制在37 ℃左右，通过注射器由工作孔道注入20 ml灌洗液后进行负压吸引回吸收灌洗液，需保证吸收率＞40%。

1.4.2 荧光定量PCR检测TB-DNA

无菌灌洗瓶取回收的灌洗液5 ml，Eppendorf试管回收黏膜毛刷标本5 ml，各加入4% NaOH溶液，振荡5 min，室温放置30 min，2000 r/m离心10 min，弃上清液，在所得沉淀物样本中加入50 μl DNA提取液，振荡混匀后，行沸水浴10 min，10000 r/min离心5 min，取上清液进行DNA扩增。采用结核核酸检测试剂盒进行检测，严格遵照试剂盒说明书步骤进行操作。

1.5 观察与评价标准

(1)肺泡灌洗液或黏膜毛刷标本培养分离得到分枝杆菌，后续鉴定明确为结核分枝杆菌，即可确诊为肺结核。

(2)统计不同支气管镜介导标本的患者诊断阳性率。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对所得数据进行分析。计数资料采用n(%)表示，组间比较采用x2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同介导标本的TB-DNA 检测结果分析

肺泡灌洗液提取标本采用TB-DNA检测显示，234例患者中阳性144例，黏膜毛刷刷检提取标本阳性213例，肺泡灌洗液提取标本阳性诊断率低于黏膜毛刷刷检提取标本的阳性诊断率，差异具有统计学意义(x2=19.32，P＜0.05)，见表1。

表1 肺结核患者不同检查方法的TB-DNA检测结果

2.2 安全性分析

234例患者均顺利完成支气管镜检查，其中1例患者发生黏膜出血，2例气促，1例气胸，不良事件发生率为1.7%，给予对症处理后均缓解。

3 讨论

肺结核疾病临床治疗中早期准确诊断及采取针对性的治疗方式对结核病患者预后有重要意义。有研究[7]指出，痰涂片抗酸染色在针对肺结核疾病临床诊断中应用价值较为显著，其具有简便、快捷及特异性高的优点。但上述检查方法在实际临床应用时阳性检出率较低，敏感度起伏程度较大，因此造成的误诊与漏诊情况较为明显[8]。Campos等[9]认为，入院治疗的肺结核患者在进行痰涂片检查时，超过50%的患者检测结果均呈阴性，其认为造成上述情况发生的原因主要为：细菌负荷程度低、痰液质量低、涂片质量低、患者自身存在免疫缺陷以及引流支气管不畅等。痰菌阴性的肺结核患者隐匿性极高，因此临床诊断较为困难，同样均有一定传染性，对患者生活质量影响程度较高，甚至未经及时治疗可能威胁到其生命安全。大多学者采用TB-DNA、痰涂片以及病理活检等方法检查，发现TB-DNA、痰涂片以及病理活检对肺结核患者敏感度与特异性最高的为TB-DNA检查[10-12]。在临床应用中发现，所采用的病理活检对肺结核患者具有一定的创伤性，且其检测结果可能受到患者自身及外界多方面因素的影响，准确性还有待商酌[13]。涂片抗酸染色一直是检测结核杆菌的首选方法，该检测方式取样简便，操作简单，检测时间短，但部分肺结核患者排菌量较少，在取得样本后送检过程中容易受到外界因素影响，多次检测重复性较差，因此检测所得阳性表达率较低。肺泡灌洗液标本采用TB-DNA检查与涂片检查法对比而言其诊断灵敏度具有较为显著的优势，同时在临床应用时具有检测时间短、受外界影响程度低的优点[14]。黏膜毛刷刷检作为一种新型技术已被临床应用于肺结核的诊断，通常都采用的是涂片抗酸染色法，但对应用气管镜毛刷刷检送检TB-DNA的检测方法国内尚未见报道。随着气管镜技术的推广普及，必将会给肺结核的快速准确诊断带来更多的检测方法，提供更广阔的思路。

近年来，随着支气管镜检查技术在临床中的飞速发展，其在针对肺结核患者的临床诊断中逐渐受到重视。支气管镜检技术在单独应用时仅能对气管支气管结核进行诊断，而无法在内镜观察下对其他类型结核进行判断[15]。支气管镜检下毛刷刷检取样后进行细菌学以及病理学检查，取得满意效果，可有效提高对患者肺部病变情况的检出。毛刷刷检对于肺部疾病的诊断目前研究较少，王学敏等[16]通过纤维支气管镜下毛刷刷检取液通过细胞学检查在肺癌诊断中的阳性预测值为95.92%，诊断效能较高。然而本次研究中肺泡灌洗液提取标本采用TB-DNA检测阳性检出率为61.54%，明显低于黏膜毛刷刷检提取标本的阳性诊断率91.03%，差异明显。在安全性方面所有患者均顺利完成支气管镜检查，不良事件发生率为1.7%，且给予对症处理后均缓解。表明两种取材方法安全可靠，且支气管镜下黏膜毛刷刷检对疑难肺结核的诊断价值更高。

支气管镜下采用黏膜毛刷刷检取材后行荧光定量PCR检测TB-DNA对于痰涂片阴性肺结核患者具有较高诊断效能。