CUG连接蛋白1在乳腺癌组织中的表达及其对细胞活力和侵袭能力的影响*

翟媛媛，柴丽君，郑英斌，梁 冰

(郑州大学第二附属医院乳腺科，河南 郑州 450014)

乳腺癌作为女性较为常见的恶性肿瘤，是导致女性死亡的主要恶性肿瘤之一，且近年来发病率呈升高趋势[1]，严重威胁女性生存健康。研究表明，乳腺癌早期即可发生转移，转移和复发是影响患者预后的主要因素[2]。因此，积极探讨影响乳腺癌转移和复发的相关分子机制对改善患者预后具有重要意义。CUG连接蛋白1(CUG-binding protein 1，CUGBP1)作为RNA连接蛋白CELF家族成员，在调控mRNA前体剪切、翻译及降解中发挥重要作用[3]。近年来研究发现，CUGBP1与人类恶性肿瘤的发生、进展关系密切[4-5]。本研究拟分析乳腺癌组织中CUGBP1蛋白表达，并观察其对人乳腺癌MCF-7细胞活力和侵袭能力的影响，以期为乳腺癌机制研究提供基础资料。

材 料 和 方 法

1 组织样本

选取2015年3月～2017年9月在郑州大学第二附属医院择期行改良根治性手术治疗的乳腺癌患者96例，术前均未行放化疗治疗，术后病理诊断证实。均为女性，年龄25～74岁，平均年龄(54.67±10.14)岁，肿瘤直径0.8～10.8 cm(中位数4.0 cm)；病理学类型：浸润性乳腺癌82例，其它14例；根据第7版TNM分期标准：Ⅰ期19例，Ⅱ期47例，Ⅲ～Ⅳ期30例；组织学分级：Ⅰ级26例，Ⅱ级41例，Ⅲ级29例；孕激素受体(progesterone receptor，PR)：阳性61例，阴性35例；雌激素受体(estrogen receptor，ER)：阳性65例，阴性31例；发生淋巴结转移49例。术中留取乳腺癌及距离肿瘤边缘>5 cm正常癌旁组织，一部分甲醛固定，石蜡包埋保存，另一部分快速置于液氮中，-80 ℃保存。本研究通过医院伦理委员会批准，所有患者均行知情同意。

2 试剂和仪器

免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物公司；兔抗人CUGBP1多克隆抗体购自Santa Cruz；MCF-7细胞购自中科院生物化学与细胞生物学研究所；胎牛血清和胰酶购自上海斯信生物科技公司；DMEM培养液购自Gibco；CUGBP1干扰序列和阴性对照序列由上海吉玛制药技术公司设计合成；脂质体转染试剂和TRIzol总RNA提取试剂盒购自Invitrogen；MTT液购自Sigma；Transwell小室购自Corning；Matrigel购自BD；兔抗人Twist多克隆抗体购自Abcam；兔抗人E-钙黏附蛋白(E-cadherin)多克隆抗体购自武汉博士德生物公司；兔抗人波形蛋白(vimentin)单克隆抗体购自Epitomics。全自动酶标仪购自BioTek；凝胶电泳分析系统购自Bio-Rad。

3 方法

3.1免疫组化检测乳腺癌组织中CUGBP1蛋白的表达 取乳腺癌及癌旁组织石蜡标本，按4 μm厚连续切片，浸入二甲苯5 min脱蜡，梯度浓度乙醇至水，利用柠檬酸缓冲液行热修复15 min，PBS冲洗3次，浸入3%过氧化氢10 min，PBS冲洗3次，加入正常山羊血清封闭液，室温下反应15 min。将 I 抗兔抗人CUGBP1多克隆抗体按1 ∶800稀释加入，4 ℃过夜孵育，以PBS替代 I 抗作为阴性对照。PBS冲洗3次，加入 II 抗，室温下反应120 min，PBS冲洗3次，DAB显色，苏木素复染3 min，自来水冲洗5 min，脱水、透明、封片，镜下观察。根据染色强度和阳性细胞比例对结果进行判定[6]：(1)染色强度：按无着色、强黄色、棕黄色和黄褐色分别赋予0～3分；(2)阳性细胞比例：按<5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%和>75%分别赋予0～4分；(3)根据(1)×(2)得分：阴性为0～2分，阳性为>3分。

3.2细胞培养 将MCF-7细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，培养条件为饱和湿度、5% CO2、37 ℃。24 h后传代培养。取对数生长期的细胞进行实验。

3.3实验分组及CUGBP1-siRNA的转染 实验分成3组：(1)CUGBP1-siRNA组：细胞内转染CUGBP1的干扰序列5’-GCUUUGGUUUUGUAAGUUA-3’；(2)阴性对照(negative control,NC)组：细胞内转染合成的阴性对照序列5’-GCACAAUGAUUGAUACCAA-3’；(3)空白(blank)组：细胞不作任何处理。以每孔1×105将细胞接种于6孔板内，融合度达70%时转染，各组处理后继续恒温培养48 h。

3.4Western blot检测MCF-7细胞中CUGBP1、Twist、E-cadherin和vimentin蛋白的表达 取各组转染后培养48 h细胞，加入预冷的含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解40 min，4 ℃条件下离心5 min，取上清，按BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。取50 μg总蛋白，行SDS-PAGE分离，电转至聚偏二氟乙烯膜，室温下5%脱脂奶粉封闭60 min，PBST冲洗3次，将 I抗兔抗人CUGBP1、Twist、E-cadherin和vimentin抗体(稀释比例1 ∶600、1∶800、1∶500和1∶1 200)加入，4 ℃过夜孵育，PBST冲洗3次，加入 II抗，室温下孵育120 min，PBST冲洗3次，加入化学发光液，暗室下反应15 min，成像、拍照。利用ImageJ图像分析软件以GAPDH为内参照计算细胞中各蛋白相对表达量。

3.5MTT法检测细胞活力 取各组细胞，胰酶消化，接种于96孔板，调整细胞密度为每孔2×103个，继续恒温培养，分别于培养12 h、24 h、48 h、72 h和96 h时，分别向各孔加入MTT液(5 g/L)20 μL，培养3 h，各孔再加入二甲基亚砜150 μL，利用酶标仪在490 nm波长处检测各孔吸光度(A)值，每组3个复孔，实验重复3次。

3.6Transwell法检测细胞侵袭力 用无血清培养液按1∶3对Matrigel进行稀释，加入到Transwell小室上室，37 ℃风干备用。用胰酶对各组转染后培养48 h细胞，胰酶消化，离心取细胞沉淀，用不含血清培养液重悬细胞，细胞密度为5×107/L，取200 μL细胞悬液加入小室上室，将含10%胎牛血清的培养液600 μL加入下室，恒温培养1 d，0.1%结晶紫染色，镜下观察，计数穿膜细胞数。

4 统计学处理

应用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。计数资料用n(%)表示，其统计推断采用2检验；计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，多组资料比较采用单因素方差分析，多重比较采用Bonferroni校正的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 乳腺癌组织中CUGBP1蛋白表达

免疫组化结果显示，乳腺癌组织中CUGBP1阳性表达率高于癌旁组织，见图1及表1。

Figure 1.The protein expression of CUGBP1 in the breast cancer and adjacent tissues was detected by immunohistochemistry (×200).

图1 免疫组化法检测乳腺癌和癌旁组织中CUGBP1蛋白表达

2 CUGBP1的表达对乳腺癌临床指标的影响

由表2可知，CUGBP1的表达与乳腺癌患者年龄、肿瘤直径、病理学类型、PR和ER无关(P>0.05)，而与TNM分期、组织学分级和淋巴结转移相关(P<0.05)。

表1 免疫组化检测乳腺癌和癌旁组织中CUGBP1蛋白表达情况

Table 1.The CUGBP1 protein expression in the breast cancer and adjacent tissues detected by immunohistochemistry (n=96)

TissuePositiveNegative2PBreast cancer72 (75.00%)24 (25.00%)28.900<0.001Adjacent35 (36.46%)61 (63.54%)

表2 CUGBP1表达对乳腺癌临床指标的影响

Table 2.The relationships between protein expression of CUGBP1 and clinical indicators of breast cancer

Clinical indicatornCUGBP1 positive2PAge (year)0.3550.551 ≥555540 (72.73%) <554132 (78.05%)Tumor diameter (cm)1.3910.238 >24637 (80.43%) ≤25035 (70.00%)Pathological type0.1110.738 Invasive8261 (74.39%) Others1411 (78.57%)TNM staging5.2360.022 Ⅰ～Ⅱ6645 (68.18%) Ⅲ～Ⅳ3027 (90.00%)Histological grading8.7120.003 Ⅰ～Ⅱ6756 (83.58%) Ⅲ2916 (55.17%)PR0.7340.391 Positive6144 (72.13%) Negative3528 (80.00%)ER0.0160.900 Positive6549 (75.38%) Negative3123 (74.19%)Lymph node metastasis6.1280.013 Yes4942 (85.71%) No4730 (63.83%)

3 CUGBP1在转染CUGBP1-siRNA的细胞中的表达

NC组CUGBP1的蛋白表达与blank组的差异无统计学显著性，而CUGBP1-siRNA组细胞CUGBP1的蛋白表达显著低于blank组(P<0.01)，见图2。

4 各组MCF-7细胞中Twist、E-cadherin和vimentin蛋白水平的检测结果

Western blot结果表明，CUGBP1-siRNA组Twist和vimentin的蛋白水平均显著低于blank组(P<0.01)，而E-cadherin的蛋白水平显著高于blank组(P<0.01)，见图3。

Figure 2.The protein expression of CUGBP1 in the MCF-7 cells transfected withCUGBP1-siRNA. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank group.

图2 CUGBP1在转染CUGBP1-siRNA的MCF-7细胞中的表达

Figure 3.The protein expression of Twist, E-cadherin and vimentin in the MCF-7 cells of each group was determined by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank group.

图3 Western blot法检测Twist、E-cadherin和vimentin蛋白在各组MCF-7细胞中的表达

5 各组细胞活力的变化

MTT法检测各组细胞活力，结果显示，与blank组比较，CUGBP1-siRNA组24、48、72和96 h时的细胞活力显著降低(P<0.01)，见表3。

6 各组MCF-7细胞侵袭能力的变化

Transwell实验结果显示，CUGBP1-siRNA组侵袭细胞数显著低于blank组(P<0.01)，见图4。

讨 论

乳腺癌作为影响女性健康的主要恶性肿瘤之一，近年来发病率呈逐渐升高趋势，且出现年轻化趋势[7]，由于该肿瘤发病较为隐匿，早期不易被发现，尽管该肿瘤诊疗水平不断提高，但患者总体预后改善有效，死亡率仍然较高，且呈升高趋势[8]。研究表明[9-10]，乳腺癌细胞高侵袭、转移性是影响患者预后的重要因素。因此，从分子水平积极探讨影响乳腺癌发生、进展的敏感基因，对患者早期诊断及临床综合诊疗具有重要意义。CUGBP1是CELF家族重要成员，其基因位于人染色体11p11，与维持细胞质及细胞核中mRNA稳定及功能发挥密切相关[11]。研究发现，CUGBP1在胚胎发育、骨骼及脂肪分化、生殖细胞形成中发挥重要作用[12]。最近研究表明，CUGBP1在多种恶性肿瘤组织中呈高表达，参与了肿瘤发生、进展过程[13]。本研究结果显示，乳腺癌组织中CUGBP1阳性表达率高于癌旁组织，说明CUGBP1在乳腺癌组织中呈高表达，提示CUGBP1可能参与了乳腺癌发生过程。本研究结果显示，乳腺癌组织中CUGBP1蛋白在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、组织学分级Ⅰ～Ⅱ级、发生淋巴结转移组织中呈高表达，说明CUGBP1参与了乳腺癌进展过程。

本研究利用转染CUGBP1基因干扰序列的方法特异性沉默乳腺癌MCF-7细胞中CUGBP1基因表达，结果显示，CUGBP1-siRNA组细胞中CUGBP1蛋白相对表达量均低于对照序列组和空白组，提示乳腺癌细胞中CUGBP1基因表达被抑制。有研究指出，CUGBP1参与了肺癌细胞增殖过程[14]。本研究MTT结果显示，CUGBP1-siRNA组细胞24 h、48 h、72 h和96 h时细胞活力均低于blank组，说明CUGBP1可能参与了乳腺癌细胞生长过程，特异性沉默乳腺癌细胞中CUGBP1表达可有效抑制细胞活力。本研究结果显示，CUGBP1-siRNA组侵袭细胞数少于blank组，说明特异性沉默乳腺癌细胞中CUGBP1表达可有效抑制细胞侵袭能力。有研究指出，CUGBP1可能有助于显著增加上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的进展[15]。而EMT在乳腺癌发生、进展中发挥重要作用，且与乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭过程密切相关[16]。在EMT过程中，上皮标志物(如E-cadherin)会表达丢失，而间充质标志物(如vimentin)会表达上调，同时，转录因子(如Twist)则参与调控了EMT过程[17]。本研究结果显示，CUGBP1-siRNA组细胞中Twist和vimentin蛋白相对表达量均低于blank组，而E-cadherin蛋白相对表达量则升高，说明特异性沉默乳腺癌细胞中CUGBP1表达可有效抑制细胞EMT过程，提示CUGBP1可能通过调控细胞EMT过程而参与了乳腺癌细胞恶性增殖和侵袭过程。

表3 不同时点各组MCF-7细胞活力的变化

*P<0.01vsblank group.

Figure 4. The invasion ability of the MCF-7 cells in each group detected by Transwell assay (crystal violet staining, ×200). Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank group.

图4 Transwell法检测各组细胞侵袭能力的变化