秦巴山区蕙兰内生真菌多样性分析

罗阳兰，邓百万，刘军生，柏秋月，解修超，张毓文

(陕西理工大学 生物科学与工程学院/陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西 汉中 723001)

蕙兰(Cymbidiumfaberi)为兰科蕙兰属地生兰，生于湿润且排水良好的透光林地，广泛分布于我国陕西南部、甘肃南部、浙江、四川、云南和西藏东部等地。蕙兰是我国栽培最久和最普及的四大国兰之一[1]，市场需求量大。而人为的过度采挖，加之该物种本身繁殖速度慢，生长周期长，使其难以满足近年来日益增长的市场需求[2]。研究表明，内生真菌可为兰科植物的幼苗提供营养物质和植物激素等[3-4]，有助于提高幼苗成活率，并促进其生长发育[5-6]。如张晋彦等[7]利用筛选的4种内生真菌通过固体菌剂和液体菌剂2种接种方式，建立了兰花组培苗与真菌的共生培养体系，提高了幼苗的成活率。研究秦巴山区蕙兰内生真菌的多样性，分离鉴定出更多内生真菌，对开发利用秦巴山区蕙兰内生真菌资源，促进蕙兰生长发育具有重要意义。鉴于此，以陕西省略阳县、洋县和南郑区3个地点采集的野生蕙兰为试材，对其根部内生真菌进行分离鉴定，并分析内生真菌多样性，以期为秦巴山区蕙兰内生真菌资源的开发利用和资源保护提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2018年3—4月，对采集于陕西省汉中市略阳县、南郑区和洋县3个地点的蕙兰样品(无病虫害)进行内生真菌的分离。各试验样地的环境条件见表1。

表1 各样品采集地基本情况

1.2 试剂

葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、硝酸钠、硫酸亚铁、蔗糖、琼脂均为分析纯，购自上海生工生物工程有限公司。

1.3 仪器

SW-CJ-1D型单人超净工作台(上海苏净实业有限公司)、YXQ-LS-50S型高压灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、5404R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf仪器公司)、GELDOC型凝胶成像仪(美国Bio-Rad有限公司)、K960型热循环PCR仪(杭州晶格科学仪器有限公司)。

1.4 培养基

改良PDA培养基：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸二氢钾5 g/L、硫酸镁3 g/L、蕙兰组织匀浆滤液(100 g/L)100 mL、琼脂15 g/L、水900 mL，pH值自然。

察氏培养基(CA)：硝酸钠3 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、硫酸镁0. 5 g/L、硫酸亚铁0. 01 g/L、蔗糖30 g/L、琼脂15 g/L、水1 000 mL，pH值自然。

1.5 方法

1.5.1 内生真菌的分离 将蕙兰根组织用流水冲洗干净，75%乙醇处理1 min，无菌水冲洗4次，0.1%升汞处理8 min，然后用2.5%次氯酸钠消毒4 min，之后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分待用。将接入分离培养基的根组织用解剖刀切成1 cm长小段，每皿接种3块组织块，3个样地共9个蕙兰样品各接种10皿，28 ℃恒温箱培养，待菌丝长出，转接入新培养皿。菌种保藏采用改良PDA 琼脂斜面培养基，28 ℃恒温箱培养，4 ℃冰箱保藏。

1.5.2 内生真菌形态鉴定 在察氏培养基上培养，采用棉蓝染色法[8]在光学显微镜下观察菌丝体的形态和大小[9]，参考《真菌鉴定手册》[10]对其进行基本的分类鉴定。

1.5.3 内生真菌ITS分子鉴定 利用CTAB法提取分离得到的内生真菌菌株DNA，采用真菌通用引物ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对ITS序列进行扩增。PCR反应体系50 μL：2×TaqMaster Mix 25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，模板DNA 1 μL(质量浓度10 ng/μL),ddH2O补齐至50 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s， 59 ℃退火30 s，72 ℃ 60 s，33个循环；72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。将PCR产物送至上海生工生物工程有限公司测序，测序结果整理后进行Blast比对，并提交NCBI申请获得登录号，利用Mega 7.0构建系统发育树。

1.5.4 统计分析 利用分离率(Isolation rate，IR)[11]分析不同样地蕙兰内生真菌的分布情况， IR=(样本组织块中分离的菌株数/全部供试样本组织块数)×100%。

利用相对分离频率(Relative frequency，RF)[12]衡量蕙兰中某种内生真菌的优势度，RF=(样本中分离的某种内生真菌的菌株数/分离的总菌株数)×100%。

蕙兰内生真菌多样性指数和相似性系数计算方法如下：

香农-维纳指数(Shannon-Wiener index，H’)=-ΣPiln(Pi)，其中，Pi=Ni/N；

均匀度指数(Evenness index，E)=H’/lnS；

丰富度指数(Margalef index，M)=(S-1) /Log2(N)。

其中，Pi为内生真菌i的菌株数占全部内生真菌菌株数的百分数，H’为内生真菌多样性指数，S为每个样地蕙兰内生真菌种类数，N为每个样地蕙兰内生真菌总数。

辛普森指数(Simpson index，D)=1-Σ(Ni/N)2，Ni为每个样地蕙兰内生真菌i的数量，N为每个样地蕙兰内生真菌总数。

采用相似性系数(Sorenson similarity coefficient，Cs) 比较两地蕙兰样品之间内生真菌种类组成的相似程度，Cs=j/(a+b-j)。其中，j是两地蕙兰样品之间共同具有的内生真菌种类数，a是一地蕙兰样品中内生真菌的种类数，b是另一地蕙兰样品中内生真菌的种类数[12]。各样地间的相似性系数在0.25以下，为极不相似；在0.25～0.50，为不相似，0.50以上为相似。

2 结果与分析

2.1 蕙兰内生真菌的分离和鉴定结果

采用组织分离法从3个地点采集的9个蕙兰样品的270块组织中共分离得到内生真菌309株，其中，略阳县共分离出102株，南郑区共分离出93株，洋县共分离出114株。

利用形态学方法根据菌落形态特征将分离到的菌株进行初步排重、归类后，共得到内生真菌212株，其中，略阳县88株，南郑区64株，洋县60株，分离得到的内生真菌形态特征见表2。

表2 蕙兰内生真菌种类及形态学特征

续表2 蕙兰内生真菌种类及形态学特征

利用分子生物学方法进行鉴定，以ITS1和ITS4为引物进行扩增，得到长度约800 bp的扩增片段，经测序后，提交至GenBank数据库中，进行序列分析和相似性比较，取相似性大于99%的序列建立系统发育树以确定3个样地所分离菌株的系统分类地位，如图1—3所示，略阳县分离得到的88株内生真菌分属于4个门9个纲25个属；南郑区的64株内生真菌分属于3个门8个纲20个属；洋县的60株内生真菌分属于4个门11个纲20个属。

2.2 蕙兰内生真菌的种群组成及分布特征

庞雄飞等[13]研究认为，某物种占整体物种的百分比即分离率分别体现了3种情况：优势属≥10%，常见属为1%～10%，稀有属≤1%。由表3可知，蕙兰内生真菌中优势属仅有1个，为木霉属(Trichodermasp.)，其分离率和相对分离频率分别为18.52%、23.58%。常见属14个，其中，镰刀菌属(Fusariumsp.)分离率和相对分离频率分别为8.89%、11.32%，青霉属(Penicilliumsp.)分离率和相对分离频率分别为6.67%、8.49%，曲霉属(Aspergillussp.)分离率和相对分离频率分别为5.56%、7.08%等。其余30个属为稀有属。此外，不同样地的蕙兰也有各自特有的内生真菌菌属，从略阳县分离得到的内生真菌有12个独有属，分别为亡革菌属(Thanatephorussp.)、节菱孢属(Arthriniumsp.)、丛赤壳属(Nectriopsissp.)、Cephalothecasp.、Aphanoascussp.、Eladiasp.、小克银汉霉属(Cunninghamellasp.)、栓菌属(Trametessp.)、棒孢属(Corynesporasp.)、Trichaptumsp.、伞状霉属(Umbelopsissp.)和烟管菌属(Bjerkanderasp.)；南郑区有10个独有属，分别为拟茎点霉属(Phomopsissp.)、Cadophorasp.、丝孢菌属(Scedospoiumsp.)、毁丝霉属(Myceliophthorasp.)、Microdiplodiasp.、Paraconiothyriumsp.、毛壳属(Chaetomiumsp.)、瓶霉菌属(Phialophorasp.)、粒毛盘菌属(Lachnumsp.)和间座壳属(Diaporthesp.)；洋县有8个独有属，分别为炭角菌属(Xylariasp.)、壳二孢属(Ascochytasp.)、根霉属(Rhizopussp.)、角担菌属(Ceratobasidiumsp.)、Acrocalymmasp.、革孔菌属(Coriolopsissp.)、新赤壳属(Neocosmosporasp.)和鬼伞属(Coprinussp.)。

LY+数字表示略阳县样品所分离菌株的顺序编号

2.3 蕙兰内生真菌的多样性和相似性分析

由表4可知，不同样地所分离的内生真菌多样性指数不同，香农-维纳指数、均匀度指数、辛普森指数大小顺序均为略阳县>洋县>南郑区，丰富度指数、分离率、相对分离频率大小顺序均为略阳县>南郑区>洋县。由此可见，略阳县采集的蕙兰内生真菌多样性程度高，生境条件适宜，群落结构稳定。相关性分析结果表明，香农-维纳指数分别与均匀度指数、辛普森指数呈正相关关系。香农-维纳指数与均匀度指数之间的回归方程为y=0.118 8x+0.529 7，决定系数(R2)=0.592 4；香农-维纳指数与丰富度指数之间的回归方程为y=0.204 7x+0.353 7，R2=0.900 8。丰富度指数与分离率和相对分离频率呈显著正相关关系，丰富度指数与相对分离率之间的回归方程为y=47.075x-77.442，R2=0.998 6；丰富度指数与相对分离频率之间的回归方程为y=19.962x-32.808，R2=0.998 8。

NZ+数字表示南郑区样品所分离菌株的顺序编号

由表5可知，3个样地间，略阳县与南郑区，南郑区与洋县间的蕙兰内生真菌组成不相似，而略阳县和洋县间的内生真菌组成相似。

LG+数字表示洋县样品所分离菌株的顺序编号

门Phylum属Genus数量/个 Number略阳县Lueyang南郑区Nanzheng洋县Yangxian总数Total分离率/%Isolation rate相对分离频率/%Relative frequency子囊菌门Ascomycota肉座菌属(Hypocrea sp.)21693.334.25青霉属(Penicillium sp.)963186.678.49曲霉属(Aspergillus sp.)636155.567.08节菱孢属(Arthrinium sp.)10010.370.47赤霉菌属(Gibberella sp.)10120.740.94丛赤壳属(Nectriopsis sp.)40041.481.89生赤壳属(Bionectria sp.)11020.740.94毛壳属(Chaetomium sp.)04041.481.89瓶霉菌属(Phialophora sp.)02020.740.94粒毛盘菌属(Lachnum sp.)01010.370.47炭团菌属(Hypoxylon sp.)02241.481.89间座壳属(Diaporthe sp.)01010.370.47炭角菌属(Xylaria sp.)00331.111.42

表4 3个样地蕙兰内生真菌的多样性指数

3 结论与讨论

本试验从秦巴山区3个样地采集的蕙兰中共分离出212株内生真菌，分属于4个门45个属，其中，木霉属的分离率和相对分离频率最高，分别为18.52%、23.58%，为优势内生真菌类群。另外还有14个常见属和30个稀有属，这可能是因为稀有属真菌在蕙兰内部分布频率较低，或者培养基或培养条件不适宜其生长，也可能是菌株本身即为稀有属[14]，如瓶霉菌属(Phialophorasp.)、伞状霉属(Umbelopsissp.)、附毛孔菌属(Trichaptumsp.)[15]等。

多样性指数分析结果表明，略阳县采集的蕙兰内生真菌多样性程度高，生境条件适宜，群落结构稳定，其植株长势也较好，可对其生长环境条件如土壤理化性质、养分含量和酶活力等进一步研究，探索适宜蕙兰生长的环境条件，为人工栽培蕙兰提供借鉴。相似性分析结果表明，洋县蕙兰与略阳县蕙兰之间内生真菌群落结构相似，这可能是由于两地同属于秦岭山系，海拔、降水和土壤理化性质等趋于一致，而南郑区采样点位于巴山山系，与这两地的蕙兰样品中内生真菌群落结构不相似，这与SAKAMOTO等[16]认为兰科内生真菌种类与其所处地理位置具有较大的相关性的观点相一致。王倩[17]研究发现，浙江天目山、重庆金佛山的蕙兰与胶膜菌属真菌共生，河南信阳的蕙兰与腊壳菌属(Sebacinasp.)菌根真菌共生，而本研究分离的内生真菌中包含角担菌属和亡革菌属2个菌根真菌属的真菌，表明秦岭蕙兰与角担菌属和亡革菌属菌根真菌共生，这说明兰属植物与菌根真菌的共生存在地域多样性，并不是专一与胶膜菌属共生。

植物内生菌是一类重要的微生物资源，在促进植物生长、提高植物抗逆性[18]、加强生物防治[19]、生产活性次生代谢产物[20]和修复环境污染[21]等方面发挥了重要作用。本研究分离鉴定的内生真菌中有多种类群与已报道的具有应用价值的真菌为同一菌属。杨秀丽等[22]认为，瓶霉菌属(Phialophorasp.)真菌是一类具有广谱性的内生真菌，具有较高的应用价值。木霉属(Trichodermasp.)和粘帚霉属(Gliocladiumsp.)真菌均有促进植物生长、防治植物病害等作用[23-24]，小克银汉霉属真菌可对甘草次酸、青蒿素、雷诺嗪等药物进行生物转化[25-27]。本试验分离的蕙兰内生真菌应用潜力巨大，具有进一步开发利用的价值。本试验通过分离鉴定秦巴山区蕙兰内生真菌并对其进行多样性分析，了解蕙兰内生真菌群落结构，后续试验将筛选能够促进蕙兰生长、提高蕙兰抗逆性的真菌菌株，这对于开发具有生防作用的菌剂或菌肥具有重要意义，可为蕙兰内生真菌资源的开发利用提供基础。