长春花法尼基转移酶β-亚基基因的克隆及其在黄龙病菌感染过程中的表达分析

李 亚，王珠娜

(1.广东海洋大学 农学院，广东 湛江 524088； 2.郑州市林业局，河南 郑州 450015)

黄龙病(HLB)是柑橘生产上最严重的病害之一。病原菌属韧皮部杆菌属革兰氏阴性细菌，目前发现引起柑橘黄龙病的病原主要有3种，分别是CandidatusLiberibacter asiaticus(CLas)、Ca.L.africanus和Ca.L.americanus[1]。其中，CLas是危害我国柑橘各品种的唯一病原菌，由于该病原菌不能人工培养，关于病原生物学的理论研究缺乏，导致CLas与寄主植物之间的互作研究进展缓慢。长春花(Catharanthusroseus)是一种热带多年生植物，属于夹竹桃科，主要用作观赏植物。该植物能够合成多种单萜吲哚生物碱，其中长春碱和长春新碱可用作临床治疗的抗癌药物。此外，研究证实，长春花可以通过病芽嫁接或以菟丝子为媒介的方式感染黄龙病菌，而且长春花染病后叶片上的症状更明显，病菌浓度更高，因此常用作研究黄龙病的指示植物和试验材料[2-3]。

植物中，法尼基转移酶(FTase)首先在拟南芥(Arabidopsisthaliana)脱落酸(ABA)超敏型植株中被发现，其参与ABA信号传导途径[4]。在拟南芥中，编码法尼基转移酶β-亚基基因FTB的缺失或FTB的特异性抑制均可促使ABA诱导的S型防御细胞阴离子通道被激活，细胞内Ca2+浓度迅速增加；同时叶片中ABA浓度升高，最终使叶片气孔关闭[5]。研究表明，在拟南芥和亚麻(Linumusitatissimum)中，FTB也能在植物遭受病原感染和干旱时其表达量显著上升，从而诱导植物体内抗性基因的表达以抵抗不良的影响因子，但其具体机制暂不明确[6-7]。在本研究中，以研究黄龙病菌的指示植物长春花为材料，采用RACE技术获取长春花法尼基转移酶β-亚基基因crFTB，并通过实时定量PCR技术研究crFTB在CLas感染长春花过程中的表达模式，以期为解析长春花与黄龙病菌互作的分子机制提供参考。

1 材料和方法

1.1 植物材料

将长春花种子播撒于50孔育苗盆内，待幼苗长至3 cm左右时移栽至直径15 cm花盆内，待100株长春花幼苗长至20 cm时作为试验材料。将长春花幼苗随机分为试验组和对照组，每组50株，分别用已感染CLas的长春花枝条(病芽条)和健康的长春花枝条(健康芽条)作为材料，以去顶嫁接的方式对试验组和对照组的长春花幼苗进行嫁接[8]。将嫁接后的长春花苗放于阴凉处，避免阳光直射，并保持嫁接口处湿润，7 d后转移至正常环境中，隔天浇水一次。

1.2 取样方法

在病芽嫁接后0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 d(DAI：days after inoculation)，将试验组中每株长春花叶片作为独立的样品，挂好标签后直接在液氮中保存，作为RNA提取的备用材料。同时在32 DAI取所有长春花位于嫁接点下方的叶片提取DNA，依照JAGOUEIX等[9]方法对CLas进行PCR检测，以检测CLas阳性的植株作为已感染的长春花植株。取上述液氮中保存的CLas阳性植株的叶片，作为RNA提取的材料。

1.3 试验方法

1.3.1 长春花叶片总RNA提取及反转录 应用Omega Plant RNA Kit(Omega，USA)提取CLas阳性植株叶片样品中的总RNA，其完整性和浓度经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定和Nanodrop 2000(ThermoFisher，USA)测定。按照反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Takara，Japan)说明书将RNA反转录成cDNA，将得到的cDNA溶液置于-20 ℃保存备用。

1.3.2crFTBcDNA部分序列克隆 根据月季(Rosachinensis)、木薯(Manihotesculenta)和拟南芥等物种FTB基因同源序列设计引物(F：5′-GACAACCACATCGAGTATC-3′和R：5′-GTACTCGAAGTCT-TGGTCCA-3′)。以长春花叶片的cDNA作为模板，扩增crFTB基因部分序列。PCR反应体系为50 μL,包含2.0 μL cDNA、10 μmol/L的上下游引物各1.0 μL、5.0 μL 10×PCR buffer、5.0 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)、1.0 μLTaqDNA polymerase (5 U/μL)、35.0 μL ddH2O。反应条件为：96 ℃ 5 min；95 ℃ 60 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增后的PCR产物经EasyPure®Quick Gel Extraction Kit(Transgen，China)回收后，按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit(Transgen，China)说明书进行连接转化，阳性菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.3.3crFTBcDNA全长克隆 参照Clontech公司SMART®RACE 5′/3′Kit 说明书，以获得的crFTBcDNA序列为基础，设计3′端特异性引物GSP3(5′-CCGTCCTTTACGGTTCTGGA-3′)和5′端特异性引物GSP5(5′-CCAGATGAGGCAACTGACCA-3′)及In-fusion克隆引物GSP3N(5′-CGACCTTGGCTTTGCTATTGG-3′)和GSP5N(5′-TCCTGGCAACGCCTAAGAAA-3′)，3′-RACE和5′-RACE反应条件参照说明书。将扩增产物纯化并连接pMD18-T(Takara，Japan)，然后筛选阳性克隆进行测序。

1.3.4crFTB的生物信息学分析 对扩增获得的序列使用Seqman进行拼接；序列同源性比对和相似性分析应用BLAST和ClustalX 1.8软件进行；应用ProtParam和ORF Finder在线预测氨基酸序列、分子质量、理论等电点和开放阅读框(ORF)等；应用NetNGlyc和NetOGlyc在线分析蛋白质氨基酸序列中的N-糖基化位点和O-糖基化位点；应用NetPhos在线分析蛋白质氨基酸序列中的磷酸化位点；应用MEGA 5.0建立crFTB与其他物种FTB亲缘关系的进化树。

1.3.5crFTB在叶片组织中的定量表达分析 根据crFTBcDNA序列设计实时荧光定量PCR引物(F：5′-GGTGGAATAGCTGGGGAACC-3′和R：5′-GAGGCAGGTCCAAACGATGA-3′)，以18S rRNA基因为内参(F：5′-GCTTAGGCCAAGGAAGTTTG-3′和R：5′-TCTATCCCCATCACGATGAA-3′)[10]。实时荧光定量PCR以SYBER Green为染料，以1.3.1中cDNA为模板，样品中目的基因和内参基因的Ct值为3次重复的平均值，根据2-ΔΔCt法进行数据分析[11]，数据均以mRNA的相对表达量表示，分析crFTB表达模式需以第一次采集的对照样品的相对表达量进行校正，运用Duncan’s法检验分析统计学差异。

2 结果与分析

2.1 crFTBcDNA克隆与分析

利用PCR技术从长春花的cDNA中扩增到了一个长度约450 bp的片段，测序后在GenBank中进行BLAST分析，结果显示，该序列与已知植物的法尼基转移酶β-亚基基因FTB的同源性最高。利用RACE技术获得该基因的3′和5′末端序列，拼接后得到全长为1 826 bp的crFTBcDNA序列，包含150 bp 5′UTR、1 368 bp ORF和308 bp 3′UTR(图1)，在GenBank中登录号为MH461106。其ORF编码455个氨基酸，ProtParam软件分析其理论分子质量和等电点分别为50.45 ku和4.67。经NetNGlyc和NetOGlyc软件预测，crFTB基因编码的氨基酸序列第94、346位具有2个N-糖基化位点，第31位具有1个O-糖基化位点；该序列还含有酪氨酸磷酸化位点8个，苏氨酸磷酸化位点6个及丝氨酸磷酸化位点9个。

2.2 crFTB蛋白系统进化分析

BLAST分析显示，长春花crFTB蛋白与其他已知物种的FTB序列具有较高的同源性，与已公布的油橄榄樟子松变种(Oleaeuropaeavar.sylvestris)和芝麻(Sesamumindicum)的FTB蛋白最高同源性分别为67%和66%。多重比较证实，crFTB具有较好保守性(图2)，执行催化功能的活性位点和Zn2+结合位点的氨基酸残基保守性高达100%，C端区域比N端区域保守性更好。利用MEGA 5.0的Neighbor-joining(N-J)法构建crFTB与其他已知植物FTB序列的系统进化树，结果显示，长春花crFTB单独分成一支，然后与油橄榄樟子松变种、旋蒴苣苔(Dorcocerashygrometricum)等其他植物FTB蛋白聚在一起(图3)，表明目前已知的FTB氨基酸序列中，长春花和油橄榄樟子松变种的亲缘关系最近，这与BLAST的结果完全一致。

2.3 crFTB在CLas感染长春花过程中的时序表达分析

应用实时荧光定量PCR技术分析CLas感染长春花过程中叶片组织内crFTB基因的时序表达特点，结果表明，在试验组(染病植株)和对照组(健康植株)叶片中都能检测到crFTBmRNA的表达，在染病长春花的叶片中，crFTB基因的表达量呈现先升后降的模式，从4 DAI开始crFTB基因的表达量升高，到24 DAI时达到峰值，然后表达量开始下降，直到试验结束时仍显著高于健康植株中crFTB基因的表达量(图4)。染病长春花的叶片中crFTB基因的表达量在4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 DAI时分别是健康植株表达量的3、7、12、14、15、18、13、9、7、5倍。

*：终止密码子；斜体aataaa：polyA终止信号；□：蛋白质的活性位点；__：蛋白质的Zn2+结合位点

□：蛋白质的活性位点；__：蛋白质的Zn2+结合位点

3 结论与讨论

在酵母和哺乳动物中，法尼基转移酶能介导体内几种关键调控蛋白如Ras家族蛋白的转膜、cGMP的磷酸二酯化、核纤层蛋白及一些蛋白激酶的磷酸化；在植物中，法尼基转移酶参与细胞周期控制和ABA信号通路的传导[12]。本研究采用同源克隆和RACE技术获得长春花法尼基转移酶β-亚基基因crFTB的cDNA全长序列并进行了分析，结果显示，crFTB蛋白与油橄榄樟子松变种FTB蛋白同源性最高为67%，氨基酸序列中存在一些非常保守而且又具有重要功能的氨基酸残基，这表明FTB虽然在不同植物中氨基酸序列有较大差异，但通过折叠后的蛋白质高级结构可能完全相同，在不同植物中执行的功能也基本类似[13]。

植物遭受不良条件胁迫是制约其生长发育的主要因素，如病原体的入侵、干旱及盐碱地等，其中，病原体入侵不仅影响到植物体内蛋白质合成和代谢，而且直接影响其果实的品质和产量的高低。通过现代分子生物学的方法获得了大量与病原诱导相关的基因，如渗透压调节基因、抗性基因等，其中包含与植物抗性信号传导相关的法尼基修饰基因及直接参与抵御病原的功能基因[14]。目前研究表明，法尼基转移酶是生物体内参与信号转导蛋白法尼基修饰的主要功能酶，该酶由α和β 2个亚基构成，其中α-亚基负责与蛋白质底物结合和法尼基修饰过程中的转移反应，β-亚基则负责蛋白质底物的特异性识别[15]。在拟南芥中，法尼基转移酶β-亚基FTB已被证实是调节ABA信号的负调控因子，当植株处于不良环境中，可以通过降低ABA浓度改变叶片气孔直径，调控植物体内的信号分子浓度，从而增加植物的抗逆性[16]。然而，FTB在其他植物中的具体功能仍不明晰。为研究FTB在长春花遭受CLas胁迫下的表达情况，本试验选取病原侵染后不同时间点长春花叶片组织的RNA，运用荧光定量PCR检测crFTB表达水平和变化趋势，结果表明，crFTB在CLas侵染后长春花叶片中的表达量随感染时间呈现先升后降的趋势，试验组从8 DAI起至试验结束其表达水平均显著高于对照组。分析认为，在试验早期(嫁接时间小于8 DAI时)，嫁接的病芽中CLas进行繁殖并逐渐转移至长春花，寄主体内的crFTB表达量开始上升；当CLas大量入侵长春花时(嫁接时间为8～24 DAI)，crFTB为帮助寄主植物抵抗CLas的感染其表达量显著性升高；而当CLas已经感染寄主植物(嫁接时间大于24 DAI)后，crFTB表达量开始下降。寄主体内crFTB的表达量逐步上升，从而提高寄主对抗病原入侵的能力，说明crFTB确实在寄主抵抗CLas侵染过程中起重要作用。

图3 N-J法构建的FTB家族成员氨基酸序列系统进化树Fig.3 A phylogenetic tree of FTB family members based on amino acid sequences constructedwith the neighbor-joining method

*:差异显著(P<0.05)；**:差异极显著(P<0.01)

长春花为柑橘黄龙病研究中重要的指示植物和试验材料，本研究对其crFTB基因进行克隆及生物信息学分析，并通过人工嫁接的方式感染黄龙病菌后，探讨长春花叶片中crFTB在病原感染不同时间点的表达量变化，旨在进一步探索crFTB基因的功能以及其在长春花对抗黄龙病菌侵染中的作用，为研究CLas与柑橘寄主的互作提供参考。