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太白山藤梨根提取物对人喉癌细胞HeP—2生长抑制作用分析

2019-05-24郭洁张晓双刘继平

中外医疗 2019年8期
关键词:太白山依赖性喉癌

郭洁 张晓双 刘继平

[摘要] 目的 探讨太白山藤梨根提取物对人喉癌细胞HeP-2的生长抑制作用。 方法 采用细胞计数法统计人喉癌细胞HeP-2的增殖率,采用MTT(四甲基噻唑蓝)法测定太白山藤梨根提取物对HeP-2细胞的剂量-效应曲线、时间-效应曲线。采用Real-time PCR检测太白山藤梨根提取物作用HeP-2细胞后,COX-2、P65、VEGF mRNA的表达。 结果 太白山藤梨根提取物作用于HeP-2细胞后,随着药物浓度的增加,HeP-2细胞存活的百分率呈下降趋势,表现为明显的浓度依赖性。太白山藤梨根提取物各浓度作用时间在12、24、48、72、96、120 h时,表现出明显的剂量依赖关系和时间依赖关系,随着作用时间的延长和药物浓度的增加,HeP-2细胞的存活率呈明顯下降趋势。太白山藤梨根提取物作用HeP-2细胞后,随着作用时间的延长,COX-2 mRNA、P65 mRNA、VEGF mRNA的表达均受到不同程度的抑制。各作用时间的COX-2 mRNA、P65 mRNA、VEGF mRNA表达均差异有统计学意义(P<0.01)。 结论 太白山藤梨根提取物能够抑制人喉癌细胞HeP-2的增殖,这种抑制作用具有时间依赖性和剂量依赖性,其抑制作用可能与下调COX-2、P65、VEGF的表达密切相关。

[关键词] 藤梨根提取物;喉癌;环氧化酶-2;血管内皮生长因子

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2019)03(b)-0033-04

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of Taibaishan vine root extract on the growth of human laryngeal carcinoma cell line HeP-2. Methods The proliferation rate of human laryngeal carcinoma cell line HeP-2 was counted by cell counting method. The dose-effect curve and time-effect curve of Hep-2 cells in Taibaishan vine root extract were determined by MTT (tetramethylthiazolyl blue) method. The expression of COX-2, P65 and VEGF mRNA was detected by Real-time PCR after detection of Hep-2 cells in Taibaishan Fujisui root extract. Results After the extract of Taibaishan vine root extract was applied to HeP-2 cells, the percentage of HeP-2 cells surviving decreased with the increase of drug concentration, showing a significant concentration-dependent. At the 12, 24, 48, 72, 96 h, and 120 h, the concentration of the extract of Taibaishan vine root extract showed obvious dose-dependency and time-dependent relationship. With the prolongation of the action time and the increase of drug concentration, and the survival rate of HeP-2 cells showed a significant downward trend. After treatment with HeP-2 cells, the expression of COX-2 mRNA, P65 mRNA and VEGF mRNA were inhibited in different degrees. The expressions of COX-2 mRNA, P65 mRNA and VEGF mRNA were significantly different (P<0.01). Conclusion The extract of Taibaishan vine root can inhibit the proliferation of human laryngeal carcinoma cell line HeP-2. The inhibition is dose-dependent and time-dependent, which may be closely related to the down-regulation of COX-2, P65 and VEGF expression.

[Key words] Vine root extract; Laryngeal carcinoma; Cyclooxygenase-2; Vascular endothelial growth factor

喉癌是头颈部常见恶性肿瘤,随着生活环境的变化和生活方式的转变,喉癌的发病率有逐渐增长的趋势。临床上治疗喉癌常采用手术、放疗、化疗等综合治疗的方法,但耐药性、治疗效果、副作用等是面临的主要问题[1-2]。目前,寻找天然有效的植物药物对喉癌进行预防和治疗是临床研究的热点。藤梨根原产于中国,具有健脾胃、清热解毒、祛风除痹的作用。藤梨根中的三萜化合物具有抗肿瘤的活性,能够通过降低细胞内总Cr含量发挥拮抗细胞毒性及遗传毒性的作用[3]。该研究旨在探讨太白山藤梨根提取物对人喉癌细胞HeP-2的生长抑制作用。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂来源

人喉癌HeP-2细胞株购于南京凯基公司,细胞常规培养于RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)中(小牛血清购于华美生物工程公司;RPMI-1640培养基为Gibco产品),体积分数为50 mL/L CO2,37℃,饱和湿度。

藤梨根购于陕西恒庆医药有限公司(产品批号:060516),阴干后粉碎成粗粉,95%乙醇浸泡24 h(乙醇与藤梨根体积比为6:1),加热回流提取6次,浓缩后伴入硅藻土(1:1),干燥,真空抽干,研碎成粉末,经氯仿回流提取。将提取物用生理盐水进行配置。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖率测定 将对数生长期的HeP-2细胞经胰蛋白酶(购于Amresco公司)消化后接种于24孔培养板,使用计数法测定细胞增殖情况,并根据公式计算细胞群体倍增时间。细胞群体倍增时间=t×lg2/(LgNt-lgNo),t为细胞处于对数生长期的培养时间,Nt为对数生长期的终止细胞数,No为对数生长期的起始细胞数。

1.2.2 MTT法检测细胞活性 MTT(四甲基噻唑蓝)为美国Sigma公司产品。取对数生长期的HeP-2细胞,消化后(胰蛋白酶)接种于96孔培养板(浓度1×106个/L),24 h后细胞贴壁,加入2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 lg μmol/L的藤梨根提取物,对照组加入等体积RPMI-1640培养液,常规培养5 d,应用MTT比色法测定每组在570 nm波长处的吸光光度值,并根据公式将吸光光度值转换成细胞存活率,绘制太白山藤梨根提取物对HeP-2细胞的剂量-效应曲线。

取对数生长期的HeP-2细胞,消化后(胰蛋白酶)接种于96孔培养板(浓度1×106个/L),24 h后细胞贴壁,加入2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 lg μmol/L的藤梨根提取物,对照组加入等体积RPMI-1640培养液,于药物作用12、24、48、72、96、120 h后,应用MTT比色法测定每组在570 nm波长处的吸光光度值,并根据公式将吸光光度值转换成细胞存活率,绘制太白山藤梨根提取物对HeP-2细胞的时间-效应曲线。

1.2.3 Real-time PCR检测COX-2、P65、VEGF mRNA表达 由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成COX-2、P65、VEGF 的PCR引物,引物序列见表1。按照北京天根生物技术有限公司生产的SYBR GREEN RT-PCR试剂盒说明书进行PCR反应。95℃预变性10 min,94℃ 30 s,退火30 s,68℃30 s,40个循环。采用2-△△Ct法分别评估COX-2、P65、VEGF mRNA表达水平的倍数变化。

2 结果

2.1 HeP-2细胞生长曲线

由图1可见,HeP-2细胞增殖活跃,生长稳定。经统计,HeP-2细胞群体倍增时间为24.5h。可见HeP-2细胞的增殖能力较强,适合在观察生长变化的相关实验中应用。

2.2 太白山藤梨根提取物对HeP-2细胞的生长抑制作用

太白山藤梨根提取物作用于HeP-2细胞后,随着药物浓度的增加,HeP-2细胞存活的百分率呈下降趋势,表现为明显的浓度依赖性,见图2。

太白山藤梨根提取物各浓度作用时间在12、24、48、72、96、120 h时,表现出明显的剂量依赖关系和时间依赖关系,随着作用时间的延长和药物浓度的增加,HeP-2细胞的存活率呈明显下降趋势,见图3。

2.3 太白山藤梨根提取物对HeP-2细胞COX-2、P65、VEGF mRNA表达水平的影响

由表2可见,太白山藤梨根提取物作用HeP-2细胞后,随着作用時间的延长,COX-2 mRNA、P65 mRNA、VEGF mRNA的表达均受到不同程度的抑制。经统计,各作用时间的COX-2 mRNA、P65 mRNA、VEGF mRNA表达均差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

喉癌是头颈部常见恶性肿瘤,据统计,全世界喉癌的发病率为22/100万,男性发病率明显高于女性。我国是喉癌发病率较高的国家,具有地域性的特点,城市发病率高于农村,华东、华北地区的发病率高于其他地区。随着生活环境的变化和生活方式的转变,喉癌的发病率有逐渐增长的趋势。临床上治疗喉癌常采用综合治疗的方法,手术治疗是首选方法,放射治疗、化疗为治疗喉癌的主要基础手段,但耐药性、治疗效果、副作用等是面临的主要问题。如何改良放化疗的疗效和减轻不良反应的发生是目前该领域研究的热点。寻找天然有效的植物药物对喉癌进行预防和治疗具有十分重要的意义。

藤梨根为猕猴桃科软枣猕猴桃Actinidiaarguta Planch的根,绝大部分原产于中国,具有健脾胃、清热解毒、祛风除痹的作用[4]。藤梨根中的三萜化合物具有抗肿瘤的活性,能够通过降低细胞内总Cr含量发挥拮抗细胞毒性及遗传毒性的作用。有研究证实,藤梨根能够对胃癌细胞的生长发挥一定的抑制作用,除了直接杀伤肿瘤细胞,还可以诱导肿瘤细胞的凋亡。用MTT法和生长曲线的检测结果表明,藤梨根提取物对胃癌细胞有明显的抗增殖作用,抑制作用呈现浓度和时间依赖性。倒置显微镜下,不同浓度的藤梨根提取物作用于胃癌细胞48 h后,细胞之间距离增大,变圆的细胞数量增多[5-6]。董晶等[7]在研究中证实,藤梨根能够对结肠分化腺癌细胞、白血病细胞发挥明显的杀伤作用。目前,关于藤梨根对喉癌的相关作用的报道较少。

该研究中,将太白山藤梨根提取物作用于喉癌细胞,结果证实,随着药物浓度的增加,HeP-2细胞存活的百分率呈下降趋势,表现为明显的浓度依赖性。同时发现,将各浓度太白山藤梨根提取物作用12、24、48、72、96、120 h时,表现出明显的剂量依赖关系和时间依赖关系,随着作用时间的延长和药物浓度的增加,HeP-2细胞的存活率呈明显下降趋势。表明太白山藤梨根提取物对人喉癌HeP-2细胞具有直接的细胞毒性作用。

VEGF是可溶性的血管形成因子,多种肿瘤细胞中的VEGF表达水平均较高。研究证实,VEGF的高表达与肿瘤的增殖、侵袭、转移密切相关[8]。环氧化酶(COX)是催化花生四烯酸转化成前列腺素的限速酶。COX-2是COX的同工酶,除了在人体正常的生理功能中发挥重要作用,还与肿瘤细胞的生长、凋亡、侵袭、转移密切相关,据研究结果显示,COX-2抑制剂能够通过多种途径抑制肿瘤细胞的增殖[9]。NF-κB是具有多种生物学作用的重要转录调控因子,能够参与肿瘤的发生和发展。P65是NF-κB的亚单位,是NF-κB发挥生物学功能的重要成分[10]。该研究发现,太白山藤梨根提取物作用HeP-2细胞后,随着作用时间的延长,COX-2 mRNA、P65 mRNA、VEGF mRNA的表达均受到不同程度的抑制,COX-2 mRNA、P65 mRNA、VEGF mRNA均差异有统计学意义(P<0.01)。表明太白山藤梨根提取物能够通过下调COX-2、P65、VEGF的表达来抑制人喉癌细胞HeP-2的生长。

综上所述,太白山藤梨根提取物能够抑制人喉癌细胞HeP-2的增殖,这种抑制作用具有时间依赖性和剂量依赖性,其抑制作用可能与下调COX-2、P65、VEGF的表达密切相关。

[参考文献]

[1] 李燕, 朱力, 罗伟, 等. 手术与手术联合放化疗对70例喉癌患者的临床效果比较[J]. 实用癌症杂志, 2018, 33(2): 236-239.

[2] Tao Y, Tao T, Gross N, et al. Combined Effect of IL-12Rβ2 and IL-23R Expression on Prognosis of Patients with La

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