莫西沙星可浓度依赖性增加人气道平滑肌细胞Caveolin—1的表达

李慧婷 赵杰 李海泉 施萍 张衍民 杜永亮

[摘要] 目的 观察在不同浓度的莫西沙星作用下，人气道平滑肌细胞（HASMC）小凹蛋白-1（Caveolin-1，Cav-1）蛋白及mRNA表达的变化，探讨莫西沙星对HASMC发挥抗炎调节的可能机制。 方法 购买HASMC，体外传代培养，按随机数字表法分为空白对照组（M0）、莫西沙星5 mg/L（M5组）、10 mg/L（M10组）、20 mg/L（M20组），均孵育48 h后，分别应用Western blot和qRT-PCR检测Cav-1蛋白水平及mRNA表达。 结果Western blot检测显示，各莫西沙星浓度组（M5组、M10组、M20组）Cav-1蛋白表达分别为（3.02±0.43），（4.18±0.07），（4.44±0.14），均明显高于空白对照组（M0组）（1.00±0.15）（P<0.05），同时也存在浓度依赖性（r=0.77）。qRT-PCR结果显示各莫西沙星组（M5组、M10组、M20组）Cav-1 mRNA表达量（2.54±0.35），（3.26±0.22），（5.57±0.51）均较空白对照组（M0组）表达量（1.00±0.11）明显增加（P<0.05），同时存在浓度依赖性（r=0.99）。 结论 莫西沙星可浓度依赖性增加HASMC Cav-1蛋白及mRNA表达，这可能与莫西沙星对ASMC发挥抗炎作用相關。

[关键词] 莫西沙星；肌细胞，平滑肌；小凹蛋白-1

[中图分类号] R562.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2019）03（c）-0011-04

[Abstract] Objective To culture human airway smooth muscle cells （HASMCs） with moxifloxacin at various concentrations， then to observe the effects of moxifloxacin on the expression of the protein and mRNA of Cav-1， and to explore the possible mechanisms of anti-inflammatory effects of moxifloxacin on HASMCs. Methods HASMCs were bought and cultured in vitro. The cells were randomly divided into 4 groups including a control group （M0） and 3 groups to which moxifloxacin was added at different concentrations （5，10，20）mg/L， groups M5， M10 and M20 respectively）. Then the cells of different groups were incubated for 48 h. Finally the protein of Cav-1 was measured by Western blot and the mRNA of Cav-1 was measured by qRT-PCT respectively. Results The results of Western blot indicated that the expression of Cav-1 increased with the concentrations of moxifloxacin increasing （3.02±0.43）， （4.18±0.07），（4.44±0.14） respectively， and the expression of Cav-1 of these groups were all higher than that of the control group （1.00±0.15）（P<0.05）， The expression of Cav-1 showed a positive correlation with the concentration of moxifloxacin （r=0.77）. The results of qRT-PCR showed that the expression of mRNA of Cav-1 of different moxifloxacin groups M5，M10 and M20 （2.54±0.35），（3.26±0.22），（5.57±0.51） respectively were all higher than that of the control group （1.00±0.11）（P<0.05）. There was also a positive correlation between the mRNA of Cav-1 and the concentration of moxifloxacin （r=0.99）. Conclusion Moxifloxacin could increase the expression of Caveolin-1 of HASMCs in concentration-dependent manner， which may be the possible mechanism concerning the anti-inflammatory effects of moxifloxacin.

[Key words] Moxifloxacin； Myocytes， Smooth muscle； Caveolin-1

哮喘患者ASMC呈现病理状态，其可分泌大量炎症因子（如IL-6、IL-8及Eotaxin）[1]，这些炎症介质可导致气道炎症持续级联放大，反过来影响ASMC，致其增殖增加及收缩增强，参与哮喘发病。我们前期研究发现莫西沙星可抑制大鼠ASMCs炎症因子IL-8及Eotaxin的分泌[2]，但具体机制尚不清楚。近年来研究发现Cav-1在气道炎症中担当着重要角色，且哮喘患者Cav-1水平明显下调[3]，提示Cav-1对哮喘性气道炎症具有保护作用，但其具体作用机制尚不完全清楚。该研究旨在探讨莫西沙星对HASMC的Cav-1蛋白及mRNA表达的影响，探索莫西沙星对ASMC抗炎作用发挥的可能机制。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

莫西沙星（德国拜耳医药保健股份公司），Cav-1人抗山羊单克隆抗体（16447-1-AP，proteintech公司），二抗山羊抗兔IgG H&L （HRP） （ab6721，abcam公司），HSMC（3410-c，sciencell，上海武光生物科技有限公司），平滑肌细胞培养液（1101，sciencell，上海武光生物科技有限公司），荧光定量检测试剂盒（RR420A，上海驰勇生物科技有限公司）。

1.2 方法

①HASMC的培养及传代：购买得到HASMC原代细胞，贴壁法进行细胞培养，以胰酶消化法进行HASMC传代并自然纯化细胞，实验取5-6代细胞。

②Western blot检测Cav-1蛋白表达：用不同浓度（5，10，20 mg/L）莫西沙星处理HASMC 48 h，空白对照组应用生理盐水处理48 h，提取细胞总蛋白，经电泳、转膜后杂交，一抗为Cav-1人抗山羊单克隆抗体，二抗为山羊抗兔IgG，以NBT/BCIP显色。条带灰度用Image J软件分析。实验重复操作3次。

qRT-PCR 定量检测Cav-1 mRNA表达。

①细胞RNA提取：用生理盐水及不同浓度莫西沙星干预HASMC 48 h后，在细胞液中加入TRIzol试剂，提取细胞RNA。检测RNA纯度，结果显示OD260/280比值在1.8～2.0之间，表明无RNA降解，无蛋白污染。

②cDNA的合成：取总RNA提取物加入随机引物、缓冲液、逆转录酶等，混匀后在42℃温浴2 h，94℃，5～10 min，待逆转录反应完成之后，将cDNA保持在-20℃冰箱备用。

③qRT-PCR反应：引物序列如下：Caveolin-1：上游5-GCGACCCTAAACACCTCAAC-3，下游5-ATGCCG- TCAAAACTGTGTGTC-3；β-actin：上游5-TTGTTA- CAGGAAGTCCCTTGCC-3，下游5-ATGCTATCACCT- CCCCTGTGTG-3；Caveolin-1扩增片段为138 bp，β-actin扩增101bp。将PCR反应体系置于离心机以4℃、5 500 rpm，离心5 min，上机，循环程序：95℃，2 min；95℃， 15 s；60℃，50 s；40个循环。

④数据的分析：首先将实验所有的基因Ct值整理好，之后每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值，得到的数就是△Ct。换成公式就是：△Ct=Ct（目的基因）-Ct（内参基因）。用该次实验研究样本的△Ct减去对照组样本的△Ct并同时对结果取相反数，结果就是-△△Ct。最后，对-△△Ct进行2的幂运算，即2-△△Ct就得出实验组和对照组靶基因的转录倍数。

1.3 统计方法

采用SPSS 20.0统计学软件包统计分析数据。所有实验数据使用平均数±标准误。两组数据之间的比较使用Student t-检验，多组间采用单因素方差分析，药物浓度相关性分析使用pesrson相关分析检验。

2 结果

2.1 HASMC鉴定

通过在倒置显微镜下观察细胞形态及免疫细胞化学检测法鉴定培养细胞是ASMC。

2.2 莫西沙星对HASMC Cav-1蛋白表达的影响

5、10及20 mg/L莫西沙星干预HASMC48 h后，5、10及20 mg/L莫西沙星干预HASMC48 h后，各莫西沙星浓度组（M05组、M10组、M20组）Cav-1蛋白表达分别为（3.02±0.43），（4.18±0.07），（4.44±0.14），均明显高于空白对照组（M0组）（1.00±0.15）（P<0.05，n=3），同时也存在浓度依赖性（r=0.77）。见图1。

2.3 莫西沙星对HASMC Cav-1 mRNA表达的影响

qRT-PCR结果显示5、10及20 mg/L莫西沙星干预HASMC 48 h后，各莫西沙星组（M5组、M10组、M20组）Cav-1 mRNA表达量（2.54±0.35），（3.26±0.22），（5.57±0.51）均较空白对照组（M0组）表达量（1.00±0.11）明显增加（P<0.05，n=3），同时存在浓度依赖性（r=0.99）。见图2。

3 讨论

哮喘患者ASMC在哮喘发病中充当着促炎细胞及主要的炎症效应细胞双重角色[4]，其病理状态是哮喘患者气道进行性狭窄的主要原因[5]。因此，寻找针对ASMC发挥抗炎调节作用的药物及作用机制可能将为重症及难治性哮喘的控制及治疗提供新思路。

我们先期研究发现莫西沙星可直接作用于大鼠ASMC，干扰ASMC增殖[6]、诱导凋亡[7]及抑制炎症因子分泌[2]。但莫西沙星是否可直接影响HASMC并改变其生物学特性，相关研究较少。该研究中我们应用莫西沙星干预HASMC 48 h后，结果显示HASMC形态及数量发生改变，这与我们既往结论一致，即莫西沙星可直接作用于HASMC并可能改变其生物学特性。既往研究也证实莫西沙星可对多种细胞发挥抗炎作用[2，8]，但关于抗炎调节的具体机制尚不清楚。

Cav-1可通过抑制一氧化氮生成[9]及影响ASMC内钙离子浓度在气道炎症中发挥重要作用[10]，但莫西沙星对哮喘气道炎症的保护作用是否与Cav-1相关少有研究。

该试验研究发现HASMC中存在Cav-1蛋白（1.00±0.15）及mRNA（1.00±0.11）表达。应用不同浓度莫西沙星（5、10及20 mg/L）干預HASMC后，结果显示HASMC Cav-1蛋白及mRNA表达均有明显增加，且均呈现药物浓度依赖性（r=0.77，r=0.99）。由以上结论我们推测，当莫西沙星干预HASMC后，影响了Cav-1表达变化，而Cav-1表达变化可能将进一步影响气道炎症反应。但莫西沙星抑制哮喘大鼠ASMC炎症因子IL-8及Eotaxin分泌是否与Cav-1表达表达变化相关仍需更多的研究。

另外，該研究仍有不足之处，我们虽然研究发现莫西沙星可浓度依赖性影响HASMC Cav-1表达，但关于莫西沙星通过何种机制或通路发挥作用，目前尚无定论。近年来研究发现，雾化吸入莫西沙星后气道上皮细胞内浓度并未明显升高，主要因为其可诱导细胞膜P糖蛋白表达增高并启动药物外排[11]。而Cav-1作为支架蛋白构成细胞表面穴样内陷（Caveolae）介导胞吞，其可参与P糖蛋白的转运功能[12]。且有研究发现过表达Cav-1可明显提高食管鳞状细胞癌P糖蛋白mRNA及蛋白水平，敲减Cav-1将致P糖蛋白表达明显下降，提示Cav-1对P糖蛋白表达具有调控作用[13]。以上结论为该研究奠定了坚实的理论基础，但需更进一步的研究探索莫西沙星影响ASMC Cav-1表达的具体机制。

[参考文献]

[1] Black J L， Roth M. Intrinsic asthma： is it intrinsic to the smooth muscle？[J]. Clinical & Experimental Allergy， 2009， 39（7）： 962-965.

[2] Li H， Zhu S， He S， et al. Anti‐inflammatory effects of moxifloxacin on rat airway smooth muscle cells exposed to allergen： Inhibition of extracellular‐signal‐regulated kinase and nuclear factor‐κB activation and of interleukin‐8 and eotaxin synthesis[J]. Respirology， 2012， 17（6）： 997-1005.

[3] Royce SG， Le Saux CJ. Role of Cav-1 in asthma and chronic inflammatory respiratory diseases[J]. Expert review of respiratory medicine， 2014， 8（3）：339-347.

[4] Ameredes BT. Beta-2-receptor regulation of immunomodul atory proteins in airway smooth muscle[J]. Front Biosci （Schol Ed），2011，3：643-654.

[5] Pascoe CD， Seow CY， Hackett TL， et al. Heterogeneity of airway wall dimensions in humans： a critical determinant of lung function in asthmatics and nonasthmatics[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2017，312：L425-L431

[6] 李慧婷， 朱述阳， 赵杰，等.莫西沙星浓度、时间依赖性抑制大鼠 ASMC 增殖及干扰△ Ψm[J]. 中国现代医学杂志， 2014， 24（22）： 17-20.

[7] 李慧婷， 朱述阳， 裴厚霜. 莫西沙星对大鼠气道平滑肌细胞线粒体膜电位及凋亡的影响[J]. 中华结核和呼吸杂志， 2011， 34（9）： 684-687.

[8] Beisswenger C， Honecker A， Kamyschnikow A， et al. Moxifl oxacin modulates inflammation during murine pneumonia[J]. Respiratory research， 2014， 15（1）： 1-10.

[9] Bucci M， Gratton JP， Rudic RD， et al. In vivo delivery of the Cav-1 scaffolding domain inhibits nitric oxide synthesis and reduces inflammation[J]. Nat Med，2000，6：1362-1367.

[10] Sathish V， Abcejo AJ， VanOosten SK， et al. Caveolin-1 in cytokine-induced enhancement of intracellular Ca（2+） in human airway smooth muscle[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2011，301：L607-614

[11] Gontijo AVL， Brillault J， Grégoire N， et al. Biopharmaceutical characterization of nebulized antimicrobial agents in rats： 1.Ciprofloxacin， moxifloxacin， and grepafloxacin[J]. Antimi- crobial agents and chemotherapy， 2014， 58（7）： 3942-3949.

[12] Zhang Y， Qu X， Teng Y， et al. Cbl-b inhibits P-gp transporter function by preventing its translocation into caveolae in multiple drug-resistant gastric and breast cancers[J]. Oncotarget， 2015， 6（9）： 6737-6748.

[13] Zhang S， Cao W， Yue M， et al. Cav-1 affects tumor drug resistance in esophageal squamous cell carcinoma by regulating expressions of P-gp and MRP1[J]. Tumor Biol -ogy， 2016： 1-8.

（收稿日期：2019-01-10）