ARTN在食管鳞状细胞癌中的表达及临床病理联系

陈雅琪，吴燕，黄一凡，文彬

(川北医学院病理学教研室·川北医学院附属医院病理科，四川 南充 637000)

食管癌是消化道常见恶性肿瘤，我国是食管癌的高发地区，高发区发病率约121/1万，是世界低发病率地区的20倍以上，每年新发病例27万以上，其中超过20万的患者死亡，死亡率居第四位[1-2]，食管癌早期症状不明显，发现时已经是中晚期，患者预后差，若能早期发现食管癌，能极大减轻患者痛苦，提高生存率。ARTN是胶质细胞源神经营养因子家族成员之一的蛋白编码基因，ARTN与下游的GFRα3及RET形成复合物，激活SMAD家族转录因子，调节基因表达[3-4]。研究发现，ARTN蛋白在多种恶性肿瘤中表达，并发挥一定生物学作用，但ARTN与食管鳞状细胞癌的关系上不明确。本实验通过检测ARTN在食管鳞癌中的表达，来探讨ARTN与食管鳞状细胞癌临床病理参数及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 样本来源

1.1.1 免疫组化标本 收集2009年1月1日至2010年9月30日川北医学院附属医院存档确诊的食管鳞状细胞癌包埋石蜡样本本114例，患者年龄39～82岁，高级别上皮内瘤变样本17例，年龄42～75岁，食管正常组织25例(以无肿瘤的切缘替代)作对照，年龄49～78岁。

1.1.2 Western blot标本 选取2014年3月至2014年6月川北医学院附属医院心胸外科手术切除的新鲜食管肿瘤组织及配对的距肿瘤>5 cm的正常组织12例，年龄42～72岁，其中男性9例，女性3例，术后均确诊为食管鳞状细胞癌；切除后置于冰上，生理盐水冲洗后以100 mg每份分装于冷冻管，置于冷冻盒中于-80 ℃冰箱保存。

所有标本术前均未经放化疗，与患者或家属签署相关知情同意书，符合医学伦理学规定。

1.2 免疫组化

ARTN兔抗人多克隆抗体购自Abcom公司(稀释浓度1∶50)，所选蜡块冷冻后每个切白片3 μm厚，以胰腺癌标本做阳性对照，组织本身做阴性内对照，采用SP两步法检测ARTN蛋白的表达。ARTN阳性信号呈棕黄色颗粒，表达于鳞状上皮细胞膜或者细胞质。结果判读由ARTN阳性染色范围及着色强度共同确定评分。阳性染色范围以阳性细胞所占百分比划分，无细胞着色判为0分；<25%为1分；25%～50%为2分；50%～75%为3分；>75%为4分。着色强度无色为0分；着色浅黄为1分；棕黄为2分；棕褐为3分。总分将两者分数相加，由两位副高及以上级别病理医师共同打分，最后取平均分，≤2分为阴性(-)，3分为弱阳性(+)，4～5分为中等阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。

1.3 Western blot检测

蛋白提取，BCA蛋白浓度测定，凝胶配置试剂盒、上样缓冲液、电泳液、转膜液、PVDF膜、超敏ECL发光液购于碧云天公司。操作按试剂盒说明进行，取食管鳞癌组织，癌旁组织各100 mg，加入液氮研磨成粉，按100 mg加入裂解液400 μL，充分混匀，冰上裂解，低温离心，取上清液分装，上清液按4∶1加电泳缓冲液于PCR仪上99 ℃变性15 min，与配置好的凝胶上样电泳，浓缩胶80 V至分离胶时，改为120 V电泳至分离胶底部，剪裁与胶相适大小PVDF 膜，甲醇中活化15 s，转膜，5%脱脂奶粉封闭3 h；4 ℃冰箱内一抗(ARTN浓度1∶3 000，GAPDH浓度1∶2 000)过夜，次日常温二抗(1∶5 000)60 min，ECL发光，图像采集。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 不同食管组织中ARTN蛋白的表达

ARTN蛋白主要定位于细胞膜和细胞质，呈棕黄或棕褐色。ARTN蛋白在正常食管黏膜上皮中不表达，在高级别上皮内瘤变组织和食管鳞状细胞癌中的阳性表达率分别为23.5%及80.7%。癌组织阳性表达率明显高于高级别上皮内瘤变及正常食管黏膜上皮。差异有统计学意义(P<0.01)。见图1和表1。

表1 不同食管组织中ARTN表达情况

注：N为正常组织，H为高级别上皮内瘤变组织，ESCC为食管鳞状细胞癌组织。*P<0.05，与H比较；#P<0.01，与ESCC比较；△P<0.01，与N比较。

2.2 食管鳞状细胞癌中ARTN蛋白表达与临床病理特征的关系

114例食管鳞状细胞癌中，男性89例，女性25例；年龄39～82岁，中位年龄57岁。统计ARTN蛋白与患者病例参数之间的关系，ARTN表达与浸润深度，TNM分期有关(P<0.05)；与性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移无关，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 Western检测ARTN蛋白在新鲜食管鳞癌组织及癌旁组织中的表达

手术室搜集新鲜标本，术后病理均确诊为食管鳞状细胞癌组织12例，搜集配对的癌旁组织(与癌组织距离﹥5 cm)。Western blot检测以分子量36 KD的GAPDH作内参，相对表达量以ARTN与GAPDH灰度值比值表示，观察ARTN蛋白的表达情况。结果发现ARTN蛋白在食管鳞癌组织和正常组织中均有不同程度的表达，但在食管鳞癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织中，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图2。

表2ARTN蛋白的表达与食管鳞状细胞癌病理特征的关系

2.4 生存分析

为评价ARTN的表达与食管鳞癌患者预后的关系，本次实验通过电话对患者进行回访，以手术出院之日至满5年，共获得39例资料。其中18例存活，总生存率46.2%。ARTN阳性表达的30例，11例存活,5年生存率为36.7%(11/30)。阴性表达占9例，7例存活，5年生存率77.8%(7/9)，ARTN阳性表达组五年生存率明显低于阴性表达组，差别具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

3 讨论

食管癌是消化道常见的恶性肿瘤，世界各地由于癌症引起患者死亡的原因中，食管癌居第六位，每年新增病例超过48万例[5]，食管癌组织学分类分为食管鳞状细胞癌(esophagus squamous cell carcinoma，ESCC)及食管腺癌(esophagus adenocarcinoma，EAC或EAD)，欧美国家，食管腺癌的发生率有所升高，但仍以食管鳞癌为主，占80%以上[6-7]，治疗方式包括手术，放化疗及联合治疗，治疗方式的选择主要根据临床TNM分期来确定，早期T1a期或更早的高级别上皮内瘤变患者可采用内镜下粘膜剥除术，而避免食管切除术带来的手术创伤，和由其增加的死亡率[8]。胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)家族成员包含四个因子， ARTN为其中之一，ARTN与其特异性配体GFRα1/ GFRα3(糖基化磷脂酰肌醇细胞膜受体1、3)形成复合体，其中与GFRα3的作用尤为明显，再与络氨酸激酶受体(RET)结合，通过三种途径向细胞内传导信号，除维持机体神经元存活，促进神经及上皮细胞的生长，分化和趋药性方面发挥重要作用外，也与恶性肿瘤的发生相关，既往研究发现，ARTN与多种恶性肿瘤相关，女性生殖系统肿瘤多与激素相关，而激素与目前肿瘤的治疗密切相关，ARTN在女性生殖系统肿瘤如乳腺癌，子宫内膜癌中表达，除与肿瘤的发生发展，浸润转移等临床病理因素有关外，更与激素及药物治疗关系密切[9-11];呼吸系统肿瘤，ARTN在喉鳞癌，肺非小细胞癌中表达上调，与喉癌TNM分期及预后相关， 肺非小细胞癌淋巴结转移，肿瘤分期相关[12-13];消化系统肿瘤，ARTN在食管鳞癌细胞株表达上调，并促进癌细胞转移侵袭，与胃腺癌浸润深度、TNM分期相关，在肠腺癌，ARTN与肿瘤分化程度，浸润深度，Dukes分期及淋巴结转移相关，另在肝细胞肝癌，胰腺癌中均有表达，且发挥一定生物学作用[14-17]。但ARTN与食管鳞癌中的临床病理联系、预后等作用尚不明确，本次实验初步探索ARTN在正常食管组织，高级别上皮内瘤变组织及食管鳞癌组织中的表达，结果发现，高级别上皮内瘤变组织与正常组织相比，ARTN表达升高，差别具有统计学意义(P<0.01)，食管鳞癌中，ARTN表达更高，差别具有统计学意义(P<0.01)；另Western-blot结果ARTN在鳞癌组织中表达高于正常组织(P<0.01)，可见ARTN在肿瘤中表达升高，这与ARTN作为一种癌症干细胞样(cancer stem cell-like,CSC-like)作用相关，不仅具有CSC样作用，也具有促进上皮到间质转换作用，促进肿瘤的发展，并具有更高的侵袭性[18]；此外，ARTN表达水平与肿瘤浸润深度、临床分期及预后相关，浸润越深，ARTN表达程度与临床分期呈正相关，与患者生存率呈负相关，说明ARTN促进食管鳞癌进展。细胞持续增殖和生长是癌症的重要特征，肿瘤所处的微环境包括氧含量、血管生成等，在肿瘤的形成中起重要作用，肿瘤生长过程中，癌细胞之间的黏附能力下降，癌细胞由于黏附力下降，易脱落，从而形成转移，而ARTN与促进缺氧诱导因子(HIF)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达相关，能促进缺氧微环境，促进血管生长，从而促进肿瘤发生进展[16]，ARTN降低钙黏蛋白(E-cadherin)的表达，上调ARTN的表达，E-cadherin的表达下降，癌细胞粘附力下降，肿瘤的侵袭及转移能力增加[19]；实验结果与ARTN作用相符。另外，本实验研究发现，ARTN与淋巴结转移无关，这与ARTN促进肿瘤转移的作用相矛盾，分析原因：(1)ARTN促进肿瘤转移是在其某一通道上起作用，食管鳞癌中，可能不存在促进肿瘤转移的这一通道，故与淋巴结转移无关。(2)ARTN可促进神经侵袭，这个理论在既往文献中有报道，而又有神学者提出经侵袭可能是除肿瘤经典转移方式之外的新的转移方式[20]，可能本次实验中所取样本患者鳞癌转移方式除淋巴结转移外，尚存在神经侵袭方式，故与ARTN作用不全相符。(3)所取样本距今时间较长，由于环境改变，不能全排除所取样本患者发生遗传物质改变的可能。故ARTN在食管鳞癌中是否与神经侵袭相关，神经侵袭与患者临床预后的关系将是我们下一步工作目标。

综上所述，本次研究证实了ARTN在从食管鳞癌癌前病变进展到食管鳞癌的过程中，表达量逐渐升高，且与患者肿瘤浸润深度、临床分期及预后相关，推测ARTN参与食管鳞癌的进展，可望成为监测患者病情及判断预后的新的生物学指标。