MicroRNA-574-5p对冠状动脉平滑肌细胞生长的影响及其调控机制

杨晓伟，张拓伟，闫泱锦

(1.西北大学附属医院西安市第三医院心血管内科；2.西安市中医医院心血管病科，陕西 西安 710018)

冠心病(coronary artery heart disease，CAD)是由冠状动脉壁粥样硬化斑块所致，是导致患者死亡和残疾的主要原因。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的异常增殖可促进动脉粥样硬化斑块的形成，而VSMCs凋亡可能与CAD相关炎症的发生有关[1]。因此，了解动脉粥样硬化斑块发育中VSMCs的行为可为预防和治疗CAD提供可能的靶点。MicroRNAs(miRNA)是小的非编码RNA，其在转录后水平调节基因表达。在血管损伤的体内和体外研究中显示[2]，miR-23b可调节VSMCs表型转换。CAD和其并发症的病理生理机制可能与miR-133a释放入冠脉循环中有关[3]。既有研究[4]表明，在CAD患者血清中miR-574-5p表达增加，但其在CAD发生中的分子功能及调节的分子机制还尚未完全清楚。本研究通过检测CAD患者外周血中miR-574-5p mRNA表达水平，以探讨miR-574-5p对VSMCs增殖及凋亡的调控作用及分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

10例确诊为冠心病的患者及10名体检健康人来自西北大学附属医院西安市第三医院心血管内科，其对本研究的目的均知情同意。取外周静脉血制备成血清，于-80 ℃储存备用。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将正常人T/G HA-VSMC(购自美国ATCC公司)培养在含10%胎牛血清和平滑肌细胞特异性生长因子的DMEM培养基中。在37 ℃、5%CO2的条件下培养。取第3～8代细胞进行随后的实验。

1.2.2 细胞转染 严格按照说明书进行瞬时转染。采用脂质体3000(美国Invitrogen公司)将miRNA-574-5p类似物以及它的阴性对照(购自广州锐博生物科技有限公司)转染入VSMCs中。转染后48 h收集细胞，实时定量PCR检测转染效率。此外，采用脂质体2000(美国Invitrogen公司)将0.5 g pcDNA3.1/ZDHHC14或者pcDNA 3.1(由上海吉玛制药技术有限公司设计)对照质粒转染入miRNA-574-5p类似物转染的VSMCs中。于转染后48 h收集细胞，进行后续试验。

1.2.3 实时定量PCR 按照说明书，采用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)从细胞及血清中分离总RNA。随后用反转录试剂盒(美国Invitrogen公司)将RNA反转录为cDNA。LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix(美国Invitrogen公司)检测mRNA的表达。2-ΔΔCt方法进行数据分析。内参为β-actin。Primer Designing Tool在线软件设计引物。见表1。

1.2.4 细胞增殖 MTT法检测细胞增殖。将细胞以每孔103个细胞种植于96孔板中，分别培养1 d、2 d、3 d、4 d、5 d和6 d后检测细胞增殖。按照操作说明书，在每孔中加入20 LMTT溶液，离心后弃去上清，再加入150 L二甲基亚砜，摇晃10 min。用酶标仪(美国Bio-rad公司制造)在波长570 nm处读取吸光值。

表1 引物设计

1.2.5 细胞凋亡 收集对数期细胞，制成悬浮细胞后，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，再加入5 μL PI混匀。室温避光反应5～15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡比例。

1.2.6 双荧光素酶报告分析 PCR扩增ZDHHC14和突变序列的3′-UTR端，然后将扩增的序列插入pGL3荧光素酶启动子载体(美国Promega公司)中构建报告基因质粒。限制性酶切位点为XbaⅠ和FseⅠ。采用脂质体2000将miRNA-574-5p类似物和ZDHHC14 3′-UTR或者突变的3′-UTR共转染入VSMCs中，48 h后，采用Dual-GloLuciferase Assay(美国Promega公司)检测荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miRNA-574-5p在冠状动脉疾病患者血清中的表达

与正常体检者对比，CAD患者血清中miRNA-574-5p的表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2 miRNA-574-5p调节VSMCs的增殖和凋亡

与阴性对照组相比，miRNA-574-5p类似物转染后，miRNA-574-5p的表达显著提高(P<0.01)。且miRNA-574-5p显著提高VSMCs的增殖(P<0.01)，降低VSMCs的凋亡(P<0.01)。见图2。

2.3 miRNA-574-5p的靶基因为ZDHHC14

采用在线miRNA 靶基因预测软件TargetScan和MicroRNA Targets and Expression预测ZDHHC14为miRNA-574-5p的靶基因。双荧光素酶报告分析结果显示，miRNA-574-5p显著降低ZDHHC14 3’-UTR端的荧光素酶活性(P<0.01)。且miRNA-574-5p抑制ZDHHC14的表达(P<0.01)。见图3。

2.4 ZDHHC14影响VSMCs的增殖和凋亡

ZDHHC14过表达降低miRNA-574-5p诱导的VSMCs的增殖(P<0.05)，提高miRNA-574-5p诱导的VSMCs的凋亡(P<0.05)。见图4。

3 讨论

miRNAs可结合其靶基因的3′-UTRs，在转录和翻译水平调节基因的表达。研究[5-6]表明，miRNAs在自体免疫疾病、发育异常以及心血管疾病等诸多生理病理过程中发挥重要作用。近几年的研究也表明[7-8]，CAD中检测出多种miRNAs表达异常。因此，调节miRNAs的表达可能是改善某些疾病发展过程的有效措施，如其可降低血管损伤诱导的VSMCs增殖、内皮细胞再生，以及降低病理性心肌肥大[9]。miRNA-574位于人染色体的内含子区域。最初认为[10]，miR-574-5p由人染色体4上编码的Noxp20基因的第一个内含子调控的，但近期的研究发现[11-13]，miR-574-5p参与心血管疾病，肺癌和结肠癌等各种疾病。表明miR-574-5p参与众多疾病的发展过程，涉及其调控的信号途径也比较复杂。miR-574-5p可通过增加TLR9信号促进肺癌的发展[12]。在结肠癌组织中检测出上调的miR-574-5p，且其促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭[13]。此外，对心肌梗塞患者缺血部位的等级聚类分析显示，miR-574-3p和miR-574-5p表达显著增加[11]。

虽然miR-574-5p调控多种疾病，但是其在CAD中潜在的功能和分子机制仍没有完全阐明。本研究显示，与健康体检者相比，miR-574-5p在CAD患者的血清中显著上调。符合之前的研究结果，在CAD患者中，miR-574-5p表达增加[4]。此外，本研究也显示，miR-574-5p可促进VSMCs增殖，抑制其凋亡。表明miR-574-5p是CAD相关因子，可能是CAD潜在的诊断性生物标志物以及治疗的一个选择。进一步的研究表明，肿瘤抑制基因ZDHHC14为miR-574-5p的靶基因[14]。本研究也表明，miR-574-5p可以结合在ZDHHC14 3′-UTR端，抑制其mRNA的表达。

ZDHHC14是DHHC棕榈酰转移酶家族的成员。人DHHC涉及神经障碍和癌症等多种疾病，DHHC2与兴奋性突触的结构和功能可塑性相关[15]，与肝癌细胞的发展和转移有关[16]。ZDHHC14也在胃癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤以及急性白血病等多种疾病中表达异常[17]。本研究表明，ZDHHC14过表达降低VSMCs增殖，促进VSMCs凋亡。因此，miR-574-5p通过靶向ZDHHC14基因参与CAD的调控，表明它可能成为CAD治疗的一个靶点。

miR-574-5p也有其他的靶基因。miR-574-5p靶向BACE1调节认知缺陷中的心血管疾病[18]。miR-574-5p直接靶定检查点抑制因子1促进肺癌细胞增殖[13]。miR-574-5p靶向癌症细胞侵袭抑制因子调控乳头状甲状腺癌细胞增殖[19]。本研究还没有涉及miR-574-5p是否靶向调节细胞生长和凋亡的其他基因。因此，进一步的研究应该重点弄清miR-574-5p靶向其他基因在VSMCs调控中的作用。

总之，miR-574-5p在CAD患者的血清中表达增加，其过表达可通过靶向并下调ZDHHC14，促进VSMCs增殖及抑制其凋亡。miR-574-5p可能为CAD相关因子，并可能成为CAD治疗的潜在分子靶点。