经鼻胰岛素对脑出血小鼠TLR4信号表达的影响

范杨，杨进，朱媛，余巨明，蒋国会

(川北医学院附属医院神经内科，四川 南充 637000)

脑出血是一种严重的卒中亚型，具有高发病率、高致死率、高致残率及高复发率的特点。而且，随着人口老龄化、溶栓和抗凝剂的更多应用，脑出血的发病率逐渐增加[1]。迄今为止，脑出血仍无有效的治疗方法[2]。大量的研究证实，脑出血后除了颅内血肿导致组织机械压迫外，炎症和氧化应激途径促发血肿周围组织继发性脑损伤[3]。Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)在中枢神经系统先天免疫中起着重要作用，TLR4信号参与脑出血后神经炎症过程[4-5]。TLR4主要在CD11b阳性小胶质细胞中表达，经核因子NF-κB信号在脑出血后早期促进炎症细胞因子释放，TLR4敲除或阻断可减轻脑出血后继发性脑损伤病理，并改善神经功能缺损[6-7]。

当前观点认为，神经炎症是大脑各种损伤和神经退行性疾病病情进展的关键因素，在不同神经疾病中脑TLRs是诱导神经炎症起始和进展的中心环节。TLRs活化是不同器官包括中枢神经系统中诱导氧化应激、炎症反应和胰岛素抵抗的关键分子[8]。数十年来，大脑被认为是免疫不敏感器官，但目前的研究发现，中枢神经系统不仅有自己固有的免疫反应机制，而且在适当的条件下，外周炎症细胞和因子可以穿过血脑屏障来进入中枢神经系统[9]。TLRs是一组在中枢神经系统中广泛表达的糖蛋白，识别相关的分子模式(PAMPs)和内源性危险信号(破坏相关性分子模式或DAMPs)[10]。TLRs的胞内信号有两种途径：大多数TLRs经MyD88依赖信号通路(除TLR3外)，而TLR3和TLR4经非MyD88依赖信号通路，TLR4是唯一可依赖于这两条途径的TLRs，所以TLR4信号在神经炎症中起着至关重要的作用[11]。脑出血后，红细胞溶解产物导致小胶质细胞TLR4激活而促进炎症细胞因子释放，加重脑水肿与神经功能缺损。然而，应用 TLR4 特异性抑制剂阻断TLR4激活诱发的炎症效应，使脑出血后炎症反应得到明显调控，说明脑出血后TLR4激活是继发性脑损伤重要机制，TLR4是脑出血治疗的关键靶标。

既往的观念认为，大脑是胰岛素不敏感的器官，胰岛素一直作为外周组织的降糖激素而在临床中广泛应用。30年前，研究者在脑内发现了胰岛素和胰岛素受体(insulin receptors，IR)，且有研究证据表明，脑内胰岛素通过胰岛素受体及其下游信号在脑卒中、脑外伤、神经变性疾病、心境及精神障碍等神经精神疾病的发生、发展和康复过程中也有至关重要的作用[12-13]。而大脑胰岛素信号是否参与脑出血病理生理过程仍然不得而知。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验动物采用10～12 周龄的SPF级雄性C57BL/6J 小鼠25只，购于川北医学院实验动物中心，体重在22～24 g。实验过程中小鼠饲养于无菌环境，洁净水喂养，饲养环境温度维持在21 ℃左右，相对湿度维持在50%左右，日光灯提供12 h 昼/夜周期节律。小鼠数表法随机分为假手术组(n=5)、ICH组(脑出血组)和ICH+Ins组(胰岛素干预组)，脑出血和胰岛素干预组小鼠又分为12 h、和72 h组(每组n=5)。假手术组仅于麻醉后，相应部位插入微量注射针，仅有针道穿刺损伤，没有注射自体血，不考虑颅内血肿导致继发性脑组织损伤，依据动物实验管理规定，尽量减少实验动物痛苦和数量，所以仅取12 h组作为对照。胰岛素干预组于术前30 min ，给予0.5 U(5 μL)门冬胰岛素(诺和诺德，中国天津)，采用头后仰位，伸颈，用10 μL移液枪缓慢交替滴入双侧鼻腔。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠自体血脑出血模型构建 术前将小鼠称重后用4%水合氯醛360 mg/kg，稀释后按0.1 mL/10 g体重的剂量进行动物麻醉。头部固定后将注射针定位于前囟0.8 mm，旁开2 mm，深3.5 mm 位置；取小鼠新鲜自体尾动脉血20 μL，用微量注射泵，按2 μL/min速率匀速注射入小鼠脑纹状体，静止10 min后缓慢拔针，采用骨蜡封闭颅骨创口后缝合头皮[14]。术后于相应时间点取大鼠血肿周围部分脑组织，-80 ℃冰箱保存。采用Western blot和RT-PCR技术检测血肿周围组织TLR4、NF-κB和TNF-α蛋白和mRNA表达水平的变化。

1.2.2 提取RNA及RT-PCR 血肿周围组织总RNA提取，按照试剂盒常规说明进行Trizol(Gibco，USA)。所有样本均进行DNAse处理后完成逆转录cDNA合成，按照(iScriptcDNA synthesis kit，Bio-Rad，USA)试剂盒常规说明完成。样本数据分析使用Nanodrop ND-100分析仪(Thermo Fisher Scientific Inc，USA)，样品A260/A280比值为1.8～2.0。采用1 μg模板进行扩增，扩增试剂盒使用PCR-miX(天根，北京)。引物由上海生工合成，序列如下：TLR4上游引物为5’-AATCTGGTGGCTGTGGAG-3’，TLR4下游引物为5’-CCCTGAAAGGCTTGGTCT-3’；NF-κB上游引物为5’-TTCCAAGACTACGACAGCCACA-3’，下游引物为5’-GCCGCTTCCTCATATCCTCAAT-3’；对照为GAPDH上游引物为5’-TCACTGCCACCCAGAAGA-3’，GAPDH下游引物为5’-CCTGTTGCTGTAGCCGTAT-3’。PCR循环条件为：94 ℃预变性30 s，95 ℃变性2 min，然后60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s。45个循环后于72 ℃延伸45 s。反应产物TLR4为287 bp，NF-κB为346 bp和GAPDH 为428 bp，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳。对TLR4 和NF-κB的灰度值与GAPDH灰度值的比值进行分析。

1.2.3 Western blot表达检测 从-80 ℃冰箱中取出组织样本，在液氮中研磨。之后用RIPA强蛋白裂解液按照说明书步骤进行蛋白提取(碧云天生物公司，江苏)。依次进行蛋白质量浓度测量和蛋白变性等处理。使用SDS-PAGE相关试剂制备10%凝胶，随后进行电泳和转膜，并封闭4 h后加入兔多克隆抗体TLR4(1∶2 000，Abcam)，4 ℃过夜。次日加入辣根过氧化物酶偶联二抗(按1∶10 000稀释，用0.01 mol/L PBS稀释)，室温下平稳摇动2 h。洗膜后使用ECL显色、拍照和分析。

1.3 统计学分析

用SPSS 18.0统计软件，以单因素方差分析(one-wayANOVA)对结果进行分析处理。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因检测结果

采用RT-PCR方法检测TLR4和NF-KB的基因表达变化。TLR4条带位置于287 bp，NF-κB条带位置在346 bp，GAPDH位置在428 bp位置。统计结果显示，与假手术组相比，各组TLR4和NF-κBmRNA表达水平均显著增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与脑出血组12 h组相比，胰岛素治疗12 h组的两者表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与脑出血72 h组相比，鼻内胰岛素治疗72 h组的TLR4和NF-κBmRNA表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2 蛋白检测结果

前述实验检测结果说明，胰岛素治疗能够影响TLR4和NF-KB的基因表达。进一步通过Western Blot检测TLR4和NF-KB蛋白变化，结果显示，与假手术组相比，各组差异均有明显统计学意义(P<0.05)。与脑出血组12 h组相比，胰岛素治疗12 h组的两者表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与脑出血72 h组相比，鼻内胰岛素治疗72 h组的TLR4和NF-κBmRNA表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

3 讨论

大脑受各种损伤和理化因素刺激均可导致氧化应激、炎症反应和胰岛素信号受损，研究发现神经炎症与中枢胰岛素破坏密切相关。高脂饮食(HFD)或肥胖可诱导中枢胰岛素抵抗，并导致的神经元活动和迁移能力降低。TLR4基因敲除或中和炎症介质可预防这一过程，表明TLR4可能参与了中枢胰岛素抵抗的诱导过程。在糖尿病的研究中发现胰岛素抵抗、破坏PI3K/Akt的GSK3信号、解除TLR4激活的负反馈调节环路，均可加重TLR4活化导致的组织损伤[15-16]。

经鼻脑靶向胰岛素可快速、高效的提高脑内胰岛素浓度，且不经过血脑屏障(BBB)，避免了肝脏首过消除效应，除鼻粘膜轻微刺激外，几乎无毒副作用[17]。采取头后仰位，经鼻前庭滴注胰岛素后数分钟到达脑内，10～30 min达到峰值，持续2～6 h，且不影响外周血糖和胰岛素浓度[18]。经鼻脑靶向胰岛素治疗，能有效纠正疾病状态下大脑的胰岛素信号降低，是脑内胰岛素补充最为便捷有效的方式，在神经精神领域具有广阔的应用前景。TLR4的高表达因是脑出血患者预后差的独立危险因素而成为脑出血的治疗靶标。本研究主要观察经鼻脑靶向胰岛素治疗是否对自体血小鼠脑出血模型NF-κB和TLR4 mRNA和蛋白表达水平的影响。

本研究发现，脑出血后不同时间点NF-κB和TLR4蛋白和mRNA表达水平增高，在模型第3天达高峰。近年的研究认为，脑出血后NF-κB和TLR4表达上调与脑出血病理生理机制相关[7，19]。脑出血后小胶质细胞激活TLR4，尔后通过上调其下游核转录因子(NF-kB)的表达、调控TNF-α等多种炎性因子释放，进而加重脑出血后继发性脑损伤[20- 21]。经鼻胰岛素降低脑内的氧化应激并激活抗氧化应激系统，同时，在氧化应激情况下，胰岛素可以增加脑内尿酸的水平、调节谷胱甘肽过氧化物酶及谷胱甘肽还原酶的活性，从而对氧化应激产生保护作用[22]。此外，脑内胰岛素对脑内β样淀粉蛋白沉积和缺血导致的神经元损害均具有保护作用[23-24]。Ferreira等[25]的研究证实，阿尔兹海默氏病(AD)和代谢紊乱相关，大脑炎症可通过破坏胰岛素信号而严重影响神经元功能。鼻内胰岛素可经转录因子(FOXO3)影响海马的突触的可塑性，进而改善AD患者的记忆、认知功能和神经病理损害[26]。

综上所述，鼻内胰岛素治疗小鼠脑出血后TLR4表达下调，并伴有NF-kB降低。鼻内胰岛素可能通过纠正脑出血创伤和颅内血肿导致继发性脑损伤后大脑胰岛素信号紊乱，从而改善中枢胰岛素抵抗相关的神经炎症反应和TLR4及下游信号的表达异常。所以，经鼻脑靶向胰岛素治疗可能是有效的干预脑出血后TLR4靶标的一种新措施。