抗炎及抗自由基治疗对脑缺血/再灌注后成年大鼠神经干细胞增殖及BDNF和VEGF表达的影响

张小东，王艺蓉，贺诗佳，谢鹏

(1.川北医学院附属医院神经内科，四川 南充 637000；2.重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆 400016)

缺血性卒中是一种高发病率、高致残率和高死亡率的常见病和多发病。目前神经保护治疗是近年尚在试验的一种重要治疗措施[1]。目前，国内外有关抗炎和抗自由基治疗对内源性神经干细胞增殖和神经生长因子的影响情况报道较少[2]。本研究通过建立大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)，观察环磷酰胺(Cyc)、秋水仙碱(Col)和维生素C(VitC)对神经干细胞增殖和脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic growth factor，BDNF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年雄性SD大鼠140只，由重庆医科大学动物实验室提供，体质量180～200 g。给予大鼠12 h的光照/黑暗循环，并可以自由获取食物和水。

1.2 主要试剂

Brdu购自Sigma公司，小鼠抗大鼠Brdu单克隆抗体、兔抗大鼠Nestin多克隆抗体、兔抗大鼠BDNF多克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒(SA1021和SA1022)、原位杂交试剂盒及DAB显色剂购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.3 MCAO模型的建立

采用线栓法制备右侧大脑中动脉局灶脑缺血模型[3]，缺血2 h诱导缺血再灌注。假手术组进行类似的手术，但植入线栓后立即摘除灯丝(无阻塞，无再灌注)。行为学评分参照文献5分制标准，评分≥2分者为造模成功[4]。

1.4 动物分组

140只模型大鼠随机分为5组：单纯局灶缺血/再灌注组(I/R 组)、局灶缺血/再灌注+Cyc和Col(CC 组)、局灶缺血/再灌注+Col(Col 组)、局灶缺血/再灌注+VitC组(VitC 组)和假手术组(SC组)，每组28只。各种药物的给药途径分别为：Cyc：5 mg·100 g-1·d-1，用1 mL生理盐水溶解后腹腔注射；Col：10 μg·100 g-1·d-1，用1 mL生理盐水溶解后灌胃；VitC：5 mg·100 g-1·d-1，用1 mL生理盐水稀释后腹腔注射；SC组：用1 mL生理盐水腹腔注射。各组均每天给药1次，连续10 d。各组分别在给药后1、3、7、10、14、21和28 d时处死大鼠4只。处死大鼠前1 d ，每只大鼠腹腔注射Brdu，50 mg/kg，用生理盐水1 mL稀释后注射，1次/8 h，共3次。

1.5 取材

实验动物达到观察时相点时，用3.5%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛缓冲液(含1‰ DEPC)心脏灌注，断头取脑，放入4%多聚甲醛缓冲固定液(含1‰DEPC)中固定30～40 min。然后梯度酒精脱、浸蜡，石蜡包埋，切片(厚度6 μm)。取材部位：室管膜下区(Subventricular zone，SVZ)(A-P坐标，bregma -0.30～-1.2 mm)、海马齿状回(subdentate gyrus zone，SGZ)(A-P坐标，bregma -4.5～-3.14 mm)及缺血周边区。

1.6 Brdu、Nestin、VEGF和BDNF阳性细胞的检测

石蜡切片常规脱蜡至水，室温下加入复合消化酶孵育10 min；蒸馏水冲洗3次，5 min/次，加入50%甲酰胺/2×SSC，65 ℃孵育2 h；2×SSC冲洗3次，5 min/次，加入2 N/L，37 ℃孵育30 min；0.01 MPBS冲洗3次，5 min/次，0.1 M硼酸(pH=8.5)室温下孵育10 min；0.01 MPBS冲洗3次，5 min/次，加入1%过氧化氢，室温下孵育15 min；0.01 MPBS冲洗3次，5 min/次，加入封闭液，室温下孵育2 h；加入小鼠抗大鼠Brdu(1∶100稀释)，4 ℃过夜， 37 ℃复温40 min；0.01 MPBS冲洗3次，5 min/次；再加入生物素化山羊抗小鼠IgG，25 ℃孵育2 h；0.01 MPBS冲洗3次，5 min/次，SABC室温下孵育2 h；0.01 MPBS冲洗×3次，5 min/次，DAB显色7 min，显微镜下观察终止显色；苏木素轻度复染。二甲苯透明，封片。Nestin和BDNF阳性细胞检测参照免疫组化SABC法的操作步骤，原位杂交检测VEGFmRNA，按原位杂交检测试剂盒操作步骤进行，DAB显色，苏木素复染。VEGF的mRNA探针序列为：(1)5’-GCTCTACCTCCACCATG CCAAGTG GTCC CA-3’；(2)5’-GACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAG TACCC-3’；(3)5’-GCAGC TTGAG TTAAACGAACGTACTTGCAG-3’。

Brdu和Nestin阳性细胞计数部位为SVZ和SGZ。BDNF和VEGF阳性细胞计数部位为海马和缺血周边区。每只动物每个指标的每个部位各选取切片1张，选择5个视野(10×40倍)，Olympus BX14型生物医学图像分析系统进行分析，以细胞内出现棕黄色颗粒者为阳性。计数每个视野的阳性细胞后，计算每只鼠所要分析部位的平均阳性细胞数，再在同一组之间取平均值。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠Brdu和Nestin的表达

I/R后SVZ和SGZ较SC组Brdu和Nestin阳性细胞计数均明显增多，差异均有统计学意义(P<0.05)。Brdu的表达高峰期在7 d与28 d降至正常。Nestin的表达高峰期在10 d。CC组与I/R组比较，Brdu和Nestin阳性细胞数的减少具有统计学意义(P<0.05)；Col和VitC组两个部位各自阳性细胞计数的组间统计结果，与SC组比较差异有统计学意义(P<0.05)，而与单纯I/R组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，图1和图2。

表1I/R后不同时间点SVZ和SGZ处Brdu阳性细胞数

2.2 各组大鼠BDNF的表达

I/R后海马和缺血周边区的BDNF表达增强，表达高峰期均在7 d，与SC组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。CC组与I/R组比较，阳性细胞数明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；Col或VitC组较SC组表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)；而与I/R组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图3及图4。

2.3 VEGF的表达

I/R后海马区和缺血周边区的VEGF的mRNA表达增强，海马的表达高峰期在7 d，而缺血周边区的表达高峰期在1 d，与SC组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。CC组与I/R组比较，阳性细胞数明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；Col或VitC组较SC组表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)；而与I/R组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图5-图7。

3 讨论

脑缺血使缺血中心区细胞坏死，产生神经功能缺损；同时也启动了机体的自身保护和修复机制，如缺血后，对神经细胞有保护作用的BDNF[5]分泌增加，诱导神经干细胞的增殖[6]。同时脑缺血也激发PER血管的再生，如缺血后VEGF表达明显增多[7]。VEGF具有神经保护和神经营养作用，特异性地促进血管内皮细胞有丝分裂、调节血管生成，并可独自诱导新生血管形成[8]。脑缺血后的这些反应是恢复期脑功能代偿最重要的物质结构基础。

本实验选用了抗炎治疗药物Cyc和Col以及抗自由基治疗药物VitC，发现Cyc和Col联合作用对缺血再灌注大鼠神经干细胞的增殖和血管及神经生长因子的产生有抑制作用，而单独应用Col对缺血再灌注大鼠神经干细胞的增殖和血管及神经生长因子的产生既无明显促进作用也无明显抑制作用。既往研究发现VitC对发育中的脑组织[9]和体外培养的神经细胞的生长有促进作用[10]，能够减少自由基，具有抗氧化损伤的作用，但本研究却发现VitC对上述有益指标也无促进作用，与既往研究结果不一致。可能的原因与抗自由基药物的选择单一有关，后续的研究应联合超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、别嘌醇等多种抗自由基药物进行对比研究。

近年来对缺血性脑血管疾病的治疗做了大量深入的研究，但这些研究大都是干预缺血后的病理生理过程[11-12]。缺血会引起脑水肿、钙超载、局部的炎性反应、神经细胞凋亡增加、兴奋性氨基酸和自由基增多等[13]。针对这个病理生理过程提出了抗脑水肿的治疗和钙拮抗剂治疗、拮抗兴奋性氨基酸介导的毒性作用、抗炎治疗等神经保护治疗措施[14]。但按照该理论所形成的治疗体系，目前却未能够较大地推动缺血性脑血管疾病的治疗进展，缺血性脑血管疾病临床疗效仍较差[15]。既往动物实验证明有效的急性卒中神经保护剂应用于临床未能发挥神经保护作用[16-17]：部分原因可能是其仅仅延缓了缺血区神经细胞的死亡，却不能最终阻止神经元的死亡，也有可能是挽救成功的濒死神经细胞，不一定能够发挥正常功能[18]；本研究发现联合应用Cyc和Col等抗炎治疗药物对干细胞和血管的增殖不利，故推测另外一个可能的原因是神经保护剂未能促进急性期所启动的神经保护和修复机制，导致远期疗效差。

既往报道Cyc和Col治疗急性脑梗塞可以减轻脑水肿，显著地改善患者的神经功能缺损和预后，同时对缺血神经细胞有保护作用[19]；但有观点指出治疗脑梗塞的药物早期能够改善脑功能，部分原因可能是由于减轻了脑水肿，减轻了对周围组织的压迫作用，减小了梗死体积，而不是由于神经细胞增殖代偿，因为神经细胞增殖、迁移并发挥功能，且进一步与全脑进行功能整合至少应该在恢复期。同时本试验也提示，干预缺血后的病理生理过程(如抗炎治疗)虽然可能减弱某些损害，但同时可能也减弱了脑的自身保护和修复机制，因为该脑缺血过程同时也启动了脑的自身保护和修复机制。比如脑水肿减轻可能影响细胞因子的释放，从而阻止细胞因子参与神经细胞的增殖和血管的再生信号传递过程[20]，如脑梗死后TNF-α释放增加，它会加重脑水肿，但是它却明显地促进了SVZ处神经干细胞增殖[21]。因此有必要在减少脑缺血反应和促进神经修复之间寻找一个平衡点。