水杉组织培养研究

于飞飞

（山东省北镇中学 山东滨州 256600）

水杉（Metasequoia glyptostroboidesHu et Cheng)隶属杉科（Taxodiaceae）水杉属（Metasequoia），是世界上珍稀的孑遗植物，我国一级保护的特有树种［1］。人们普遍认为它在第四纪冰川期灭绝，1941年日本研究者MiKi 通过对水杉化石的研究建立了属名［2］。我国植物学家在湖北省利川市谋道溪镇发现了水杉活株，经多方鉴定，1948年胡先啸和郑万钧将其正式命名为水杉，并公布于世［3］。

目前对于水杉繁育技术的研究重点主要集中在种子繁殖和扦插育苗方面［4-7］。20世纪80年代中期，水杉多代扦插苗木生长势明显减弱并且大量出现早衰现象，科学家发现许多地区水杉苗木重复多代扦插后，普遍出现生根推迟、生根率下降、生长势衰退的情况［8］，影响了水杉种苗的推广与驯化繁殖。因此其组织培养技术的建立可以在短时间内提供大量苗木，并为以后的遗传改良、良种繁育、遗传转化研究工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 培养材料 在重庆南川金佛山自然保护区原生常绿阔叶林中，采集水杉的带腋芽茎段及顶芽为材料，培养再生植株。

1.2 培养基

1.2.1 愈伤组织诱导培养基 选取水杉生长旺盛的带腋芽茎段或茎尖，用流水冲洗30 min，无菌条件下用75%乙醇浸泡30 s，无菌水洗净，再用吐温-80（2～3 滴／100 mL）和0.2% HgCl2浸洗消毒，无菌水洗净后滤纸吸干，留取约1 cm 的长段，接种于诱导培养基中，每瓶接种3～5 个外植体，以MS 培养基为基本培养基，外加不同浓度的2，4-D、NAA、6-BA 进行离体培养，pH＝5.8，灭菌。按正交表L9（33）设计培养基表，每种激素组合接种5～6 瓶（表1），然后置于光照16 h／d，光照强度1 500 lx，（25±2）℃条件下培养。

表1 愈伤组织诱导正交实验影响因素水平表（单位：mg／L）

1.2.2 继代及分化培养基 将初代培养得到的丛生芽分割，转入继代培养基中进行增殖培养（表2）。材料接种2 周后定期观测，活性炭实验采用编号为5 的培养基，分别添加0.5 g／L、0.7 g／L、0.9 g／L、1.2 g／L 的活性炭对水杉的愈伤组 织进行继代培养。

表2 愈伤组织继代及分化培养基（单位：mg／L）

1.2.3 生根培养基 剪取健壮、叶色正常、无玻璃化的1.5～2.0 cm 长的水杉组培幼芽用于生根。以1／2 MS 为基本培养基，附加不同浓度的IBA、NAA 及一定浓度的活性炭，并定期观察它们的生长状况。培养基组合如表3所示。

表3 小苗生根培养基（单位：mg／L）

2 数据统计

2.1 愈伤组织诱导率统计 所有外植体从开始形成愈伤组织后，每3 d 观察一次。以第24 天观察统计的数据计算愈伤组织诱导率。初愈时间为在外植体上出现肉眼可见愈伤组织的时间，愈伤组织诱导率=（出愈外植体数／接种无感染外植体数）×100%。

2.2 继代培养过程中分化情况及褐化率统计 继代培养后，每5 d 观察一次，记录愈伤组织生长情况，后进行分化情况统计，20 d 后进行褐化情况统计。

3 结果与分析

3.1 愈伤组织的诱导 正交实验结果见表4和表5。在不同的激素种类及浓度的处理中，水杉外植体大部分都能产生愈伤组织。采用培养基MS+2，4-D（2.0 mg／L）+NAA（3.0 mg／L）+6-BA（1.5 mg／L），水杉愈伤组织诱导率为91.4%，初愈时间为20 d 左右（图1）。

表5 外植体愈伤组织诱导正交实验方差分析表

3.2 愈伤组织的继代与分化 从表6可以看出，不同激素及其配比对水杉愈伤组织的继代及分化存在明显差异，分化培养基最佳为MS+NAA（0.2 mg／L）+6-BA（1.5 mg／L），出芽率为30.2%（图2显示愈伤组织形成芽点）。由表7方差分析可见，其中6-BA 浓度对萌芽率的影响及为显著，而NAA 浓度对萌芽率的影响不显著。

表6 愈伤组织继代及分化实验结果分析

表7 愈伤组织继代及分化实验方差分析表

3.3 5 号培养基褐化结果分析 水杉外植体的褐变现象比较严重，0.9 g／L 的活性炭对于防止外植体褐变效果最好，可以把褐变率降低到25.9%并保持较高的出芽率（21.5%）。但是，实验结果显示活性炭能够阻碍组培苗茎的伸长，而促进叶的迅速生长。

3.4 水杉组培苗生根结果分析 由表8可以看出，水杉不定根的诱导比较困难，在1／2MS+NAA（3.0 mg／L）+IBA（0.1 mg／L）培养基上生根率最高仅为18.8%（图3）。将已经生根的小苗转移到不含激素的MS 培养基上，根系会继续伸长生长并且发生不定根（图4），培养15 d 后平均根数可达到45条，平均根长达2.56 cm，最长根长4.51 cm。

表8 水杉组培苗生根诱导实验结果

表9 水杉组培苗生根诱导实验方差分析表

4 结论

4.1 水杉愈伤组织诱导率高 本实验中，水杉外植体萌动率较高，研究发现，采用培养基MS+2，4-D（2.0 mg／L）+NAA（3.0 mg／L）+6-BA（l.5 mg／L），水杉愈伤组织诱导率为91.4%，初愈时间为20 d左右。水杉在继代培养中观察到3 种类型的愈伤组织：①质地疏松或致密的黄色愈伤组织，多次继代培养生长快；②质地致密黄绿色或白色的愈伤组织，多次继代培养仍能增殖；③质地疏松黄褐色的愈伤组织，生长缓慢，在继代培养中绝大多数变褐死亡，只有其中少数愈伤组织能产生新的白色愈伤组织。

4.2 水杉组培成苗率低 水杉离体组织培养获得再生植株从理论上应该可以成功，却只有少部分成苗，未能获得突破性进展。探究原因，可能主要在以下2 个方面：一是该属植物遗传特性所致，水杉为木本裸子植物，木本植物再生率低一直是困扰其再生的主要原因；二是所提供的培养条件可能不适于水杉外植体的生长，通常外植体的萌发成苗与光照、温度、水分和通气条件等因素密切相关，同时其代谢产物也会或多或少影响植株的生长。最佳分化培养基组合为MS+NAA（0.2 mg／L）+6-BA（1.5 mg／L），出芽率为30.2%，丛芽产生率较低。最佳生根培养基组 合为1／2MS+NAA（3.0 mg／L）+IBA（0.1 mg／L），生根率最高仅为18.8%。