自体全血注射对自体血清皮肤试验阳性的难治性慢性自发性荨麻疹患者嗜碱性粒细胞FcεRⅠ与CD63表达的影响

罗金成 陈曙光 刘文英 徐艳 宋志强

陆军军医大学第一附属医院皮肤科，重庆 400038

自体血清皮肤试验（autologous serum skin test，ASST）阳性的慢性自发性荨麻疹（chronic spontaneous urticaria，CSU）患者的症状和体征较ASST阴性CSU患者更重，更容易对抗组胺治疗抵抗，病程也更长，其治疗在临床上是一大棘手问题［1］。10%～50%的慢性荨麻疹患者对常规剂量抗组胺治疗反应欠佳，有学者将其定义为慢性难治性荨麻疹［2］。国内外研究［3-6］证实，自体全血注射（autologous whole blood injection，AWBI）和自体血清注射有助于改善ASST阳性的慢性荨麻疹患者的临床症状，但其作用机制尚不清楚。国外已有报道CSU患者外周血嗜碱性粒细胞数目与病情严重程度负相关［7］。新近研究发现，奥马珠单抗治疗慢性荨麻疹的疗效机制与其显著下调嗜碱性粒细胞FcεRⅠ受体的表达有关［8］。我们观察AWBI治疗前后CSU患者嗜碱性粒细胞FcεRⅠ与CD63表达的变化，旨在阐明AWBI治疗的可能机制。

对象与方法

一、研究对象

1.研究对象：2017年11月至2018年6月陆军军医大学第一附属医院皮肤科门诊收治的ASST阳性难治性CSU患者80例。

2.纳入标准：①临床诊断为CSU，风团和瘙痒反复发作持续6周以上；②ASST阳性（反应等级＞++）；③采用一种抗组胺药遵循药品说明书推荐剂量规范治疗2周以上而不能有效控制病情［周荨麻疹病情活动程度（UAS7）≥16分］［9］；④年龄12～70岁；⑤自愿参加临床试验研究且能够按临床研究方案执行。另外，在筛选ASST阳性患者时，征得部分ASST阴性患者知情同意后，收集其行ASST试验后剩余的血清用于血清诱导的嗜碱性粒细胞CD63活化试验。

3.排除标准：物理性荨麻疹、遗传血管性水肿及由其他明确原因（如药物、感染等）引起的荨麻疹；同时伴有血液系统肿瘤、自身免疫性疾病、上呼吸道感染或正在接受抗凝血药物或系统糖皮质激素治疗者；孕妇及哺乳期妇女。

4.分组：采用随机数字表法将患者分成AWBI组（40例）与对照组（40例）。AWBI组女30例，男10例，年龄18～69（39.98±12.38）岁，病程中位数6个月（范围3～72个月）。对照组女29例，男11例，年龄13～67（37.50±12.95）岁，病程中位数6个月（范围3～66个月）。两组的性别（χ2=0.065，P＞0.05）、年龄（t=0.168，P＞0.05）以及病程（U=735，P＞0.05）差异均无统计学意义。选取同期我院体检中心25例健康志愿者作为健康对照组。本研究获得陆军军医大学第一附属医院伦理委员会批准（审批号KY201009），受试者均签署知情同意书。

二、治疗方案与疗效及不良反应评估指标

1.治疗方案：对照组与AWBI组均给予氯雷他定联合依巴斯汀治疗，氯雷他定10 mg每日晨服，依巴斯汀10 mg每晚口服。AWBI组患者同时接受AWBI治疗，治疗方案参照文献［3］，即将采集的肘正中静脉血直接臀部深部肌内注射，每周1次，第1次2.5 ml，第2～4次5 ml，第5～8次7.5 ml，第9～12次10 ml，连续12周。

2.疗效及不良反应评估：分别在入组时与第12周治疗结束时采用UAS7量表与皮肤病生活质量指数（dermatology life quality index，DLQI）量表评估疗效［9］。UAS（包含风团与瘙痒两个指标）范围0～6分；UAS7为连续7 d的UAS分值的累计值，范围0～42分，分值与疾病活动程度呈正相关。DLQI量表包含10个问题，每个问题均采用4级计分法，分值越高说明慢性荨麻疹对患者的日常生活的负面影响越大，生活质量越差。在整个治疗期间，监测患者病情并记录与AWBI治疗相关的不良事件。

三、实验室检查

1.ASST：按照国外文献［10］及我科建立的方法［3］进行。常规采集受试者静脉血2～3 ml置于无菌非抗凝管中，室温静置30 min后（400～500）×g离心10 min，取上层血清0.05 ml在前臂屈侧皮内注射，同时用10 g/L盐酸组胺和生理氯化钠溶液进行皮肤点刺作为阳性和阴性对照。30 min后由专人判读结果，根据血清与组胺所致风团面积比来判定反应等级。无反应者判为阴性，风团直径为阳性对照的1/3判为+，2/3判为++，相同判为+++，大于阳性对照判为++++。

2.主要实验仪器及试剂：FACSCantoII流式细胞仪产自美国BD公司。荧光标记单克隆抗体包括别藻蓝蛋白（APC）标记的CD123抗体、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD63抗体、多甲藻黄素叶绿素蛋白-花青素5.5（Percp-cy5.5）标记的人白细胞抗原DR（HLA-DR）抗体以及分别由荧光素FITC、Percp-cy5.5以及APC标记的同型对照抗体亦均为美国BD公司产品；藻红蛋白（PE）标记的FcεRⅠα抗体、PE标记的同型对照抗体以及免疫球蛋白Fc受体封闭剂均为美国BioLegend公司产品。甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（N-formyl-methionylleucyl-phenylalanine，fMLP）为美国Sigma公司产品。

3.嗜碱性粒细胞表面FcεRⅠα检测：参考文献［11］方法，在AWBI治疗基线（w0）、4周（w4）、8周（w8）与12周（w12）抽取AWBI组患者（30例）外周静脉血300 μl至无菌抗凝流式管，平均分为两组，均加入5 μl Fc受体封闭剂4℃封闭15 min。实验组加入CD123-APC、HLA-DR-Percp-cy5.5、FcεRⅠα-PE单克隆抗体各5μl，对照组加入CD123-APC、HLA-DR-Percp-cy5.5、PE-同型对照单克隆抗体各5 μl，4℃避光孵育15 min。各组加1×红细胞裂解液2 ml避光孵育15 min。离心去上清液，PBS洗涤1次，150 μl PBS重悬后上机检测。采用流式细胞仪对嗜碱性粒细胞及其FcεRⅠα受体划门（图1）。各组均收集侧向角散射光（side scatter，SSC）低密度CD123阳性HLA-DR阴性的嗜碱性粒细胞500个。嗜碱性粒细胞表面FcεRⅠα受体的表达以平均荧光强度（median fluorescence intensity，MFI）表示。

图1 流式细胞仪对嗜碱性粒细胞及其FcεRⅠ受体的划门策略1A：选取SSClowCD123+细胞群（R1门）；1B：在R1门中选取HLA-DR阴性细胞群（R2门）即为SSClowCD123+HLA-DR-嗜碱性粒细胞；1C：同型对照抗体（左侧）或FcεRⅠα抗体（右侧）标记的嗜碱性粒细胞直方图

4.血清诱导的嗜碱性粒细胞CD63活化试验：参照文献［12-13］，从AWBI组患者中按入组时间顺序选择后30例ASST阳性的CSU患者，在AWBI治疗不同时点进行嗜碱性粒细胞活化试验。实验前预先收集30例ASST阳性与ASST阴性CSU患者血清（1 ml/例），各自混合后，于56℃灭活30 min制备ASST阳性血清与ASST阴性血清，分装后冻存于-80℃。实验分组及干预：在AWBI不同时点（第0、4、8、12周）取AWBI组30例患者外周静脉血500 μl平均分成5组，A组加入上述灭活的ASST阳性混合血清100 μl，B组加入灭活的ASST阴性混合血清100 μl，C组加入甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（10-6mol/ml）作为阳性对照，D组加入PBS 100 μl作为阴性对照，E组不加刺激物。A～D组置于37℃培养箱中温育15 min后，立即置于碎冰中5 min以终止嗜碱性粒细胞脱颗粒反应，然后均加入CD123-APC、HLA-DRPercp-cy5.5、CD63-FITC荧光抗体各5 μl；E组加入CD123-APC、HLA-DR Percp-cy5.5、FITC-同型对照各5 μl为荧光同型阴性对照组，4℃避光染色15 min。各组加入1×红细胞裂解液2 ml避光孵育15 min，离心去上清液，PBS洗涤重悬细胞后上机检测。各组均收集SSClowCD123+HLA-DR-嗜碱性粒细胞500个并记录CD63表达百分比。

四、统计学方法

采用GraphPad Prism7.00软件处理实验数据。根据D′Agostino & Pearson正态性检验的结果，计量资料用±s或中位数（四分位数间距或范围）表示，两组UAS7和DLQI比较采用t检验。两组FcεRⅠα表达水平比较采用Mann-WhitneyU检验，不同时点的两两比较采用Wilcoxon′s配对秩和检验。采用Spearman相关系数评估指标的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、CSU患者治疗前后UAS7、DLQI比较

整个临床试验过程中，所有患者均按要求完成治疗，无退出及失访病例。见表1。两组患者治疗前（入组时）UAS7评分、DLQI指数差异均无统计学意义（P＞0.05）；第12周治疗结束时两组上述指标均显著低于治疗前（均P＜0.01），且AWBI组治疗后UAS7及DLQI评分显著低于对照组（均P＜0.01）。

表1 自体血清皮肤试验阳性的难治性慢性自发性荨麻疹患者治疗前后UAS7与DLQI评分比较（±s）

表1 自体血清皮肤试验阳性的难治性慢性自发性荨麻疹患者治疗前后UAS7与DLQI评分比较（±s）

注：与治疗前相比，aP＜0.01。UAS7：周荨麻疹病情活动程度；DLQI：皮肤病生活质量指数；AWBI：自体全血注射

组别对照组AWBI组t值P值例数40 40 UAS7治疗前26.90±5.22 27.15±4.53 0.23 0.82治疗后19.93±6.32a 14.25±7.56a 3.64＜0.01 DLQI治疗前17.08±6.79 16.88±6.01 0.14 0.89治疗后13.93±5.43a 8.48±4.15a 5.04＜0.01

二、AWBI安全性评价

在治疗的前6周，注射自体全血后24～48 h内有13例（32.5%）的患者出现轻度的一过性“风团激发”现象，后6周仅有4例出现此现象，患者均可耐受，服用第二代抗组胺药24 h内消退。整个治疗过程中，无患者出现明显血肿、硬结或过敏性休克。

三、AWBI治疗前后嗜碱性粒细胞FcεRⅠ表达水平的变化

ASST阳性CSU患者FcεRⅠα基线值显著高于健康对照组（U=83，P＜0.001），AWBI组治疗4周时显著低于基线水平（W=-447，P＜0.001），治疗8周时亦显著低于4周时（W=-325，P＜0.001）。见图2。

四、ABWI治疗前后CSU患者嗜碱性粒细胞CD63表达变化

见图3。ASST阳性血清诱导的CD63表达水平在第4周时较基线显著降低（W=-263，P＜0.01），第8周时亦显著低于第4周时（W=-319，P＜0.001）；ASST阴性血清诱导的CD63表达在第4周时亦较基线显著降低（W=-329，P＜0.001），且第8周较第4周亦显著降低（W=-249，P＜0.01）。

图2 自体血清皮肤试验（ASST）阳性慢性自发性荨麻疹（CSU）患者接受自体全血注射治疗前后嗜碱性粒细胞IgE高亲和力受体α链（FcεRⅠα）的表达2A：健康人和ASST阳性CSU患者治疗前嗜碱性粒细胞FcεRⅠα表达的比较；2B：ASST阳性CSU患者FcεRⅠα表达动态变化。a：P＜0.001；b：P＞0.05

五、AWBI治疗前后FcεRⅠα与CD63变化的相关性分析

AWBI治疗前至第4周、第4～8周以及第8～12周时FcεRⅠα的变化值（前一时点数值减去后一时点数值的差值）与ASST阳性血清诱导的CD63变化值均呈不同程度正相关，r值分别为0.364、0.422、0.455，P值均＜0.05。见图4。

讨论

图3 自体全血注射对自体血清皮肤试验（ASST）阳性的慢性荨麻疹（CSU）患者嗜碱性粒细胞CD63表达影响ASST阴性和ASST阳性CSU患者混合血清分别诱导的CD63表达水平均随治疗时间的延长而下降

1986年Grattan首次报道部分慢性荨麻疹患者进行ASST后可诱导局部出现风团红斑反应。后续研究发现ASST阳性的CSU患者外周血往往携带有可诱导肥大细胞或嗜碱性粒细胞活化的组胺释放因子，主要包括抗FcεRⅠ或抗IgE功能性IgG型自身抗体［9，14］。一项多中心流行病学调查［1］显示我国慢性荨麻疹患者ASST阳性率为66.9%。然而也有研究显示健康人群同样可出现ASST阳性反应（甚至高达40%～45%）［15］，因此ASST仅可作为筛选慢性荨麻疹患者是否存在血清组胺释放因子的非特异性检测方法。对外周循环中组胺释放因子释放活性的定量检测可采用基于流式细胞术的嗜碱性粒细胞活化试验，该试验主要用于检测CSU患者血清刺激后嗜碱性粒细胞活化标志物（CD63或CD203c）的变化情况，以评估CSU患者的疾病活动程度。虽然有研究报道外周血嗜碱性粒细胞数目与荨麻疹病情严重程度有相关，然而所采用的实验方法主要为用于基础研究的流式细胞术而非临床上常用的血常规，文献［16］报道采用手工血细胞涂片与血细胞自动分析仪（血常规）两种方法检测出的嗜碱性粒细胞数目差异很大而不具有一致性。将来仍需更多的实验研究来评估血常规嗜碱性粒细胞计数的应用价值，2018版国际荨麻疹指南不建议将外周血嗜碱性粒细胞计数作为评估荨麻疹病情的指标［9］。

图4 30例自体血清皮肤试验（ASST）阳性的难治性慢性自发性荨麻疹患者自体全血注射治疗不同时段IgE高亲和力受体α链（FcεRⅠα）变化值与ASST阳性血清诱导的CD63嗜碱性粒细胞变化值的相关性分析MFI：平均荧光强度

近十多年来随着荨麻疹血清中各种类型的组胺释放活性因子陆续被鉴定，古老的自血疗法重新受到重视，逐渐被各国应用于难治性慢性荨麻疹的临床治疗中。本研究显示，40例ASST阳性CSU患者经AWBI治疗后UAS7以及DLQI评分显著降低，与自身治疗前以及对照组相比均有统计学差异，该结果与国内外既往研究［3-6，17］一致。也有研究者报道AWBI治疗荨麻疹的临床疗效并不显著优于安慰剂注射［18］。由于目前缺乏高质量的循证医学证据，目前学术界对AWBI治疗荨麻疹的有效性仍存在争议，2018版国际荨麻疹指南［9］仅把AWBI作为治疗CSU“可能有效”的一种替代手段。然而基于其不良反应少、成本低以及技术简易等优势，中国、印度等发展中国家的荨麻疹指南［19-21］指出可考虑选用AWBI治疗ASST阳性的难治性慢性荨麻疹。AWBI治疗ASST阳性慢性荨麻疹的作用机制目前仍未清楚，可能与促进机体对组胺释放因子发生免疫耐受有关［22］。

10年前有研究显示，抗IgE抗体可明显减少人嗜碱性粒细胞FcεRⅠ及其相关通路蛋白表达［23］。本研究证实，ASST阳性CSU患者嗜碱性粒细胞FcεRⅠ表达较健康人群明显升高，经过AWBI治疗4周及8周后FcεRⅠ表达显著减少。我们课题组之前的研究和国外研究［12，24］证实，CSU患者嗜碱性粒细胞CD63表达较健康人明显升高，而CD63的高表达与机体处于变应原致敏状态（变应原皮肤点刺试验阳性与血清特异性IgE水平升高）、自体血清皮肤反应性（ASST阳性）以及荨麻疹患者自身嗜碱性粒细胞的高反应性相关。本研究发现，在AWBI治疗的不同时点，用同一批ASST阳性或阴性混合血清刺激患者嗜碱性粒细胞后，其CD63表达水平呈明显下降趋势，说明经过AWBI治疗后嗜碱性粒细胞对富含组胺释放因子的血清刺激的内在敏感性降低。

我们还发现，CD63表达变化与FcεRⅠ表达的变化基本吻合，AWBI治疗不同时段两者变化值均有明显相关性。因此推测，AWBI治疗对IgE-FcεRⅠ-CD63信号通路以及嗜碱性粒细胞反应性的抑制是AWBI发挥类似减敏作用的机制之一。值得一提的是，我们观察到在接受AWBI治疗后48 h内部分荨麻疹患者出现一过性“风团激发”现象，推测可能是富含抗FcεRⅠ或IgE自身抗体等组胺释放因子的自体全血进入患者肌肉组织后，导致局部内环境发生变化，一过性诱导激活肥大细胞或嗜碱性粒细胞大量脱颗粒（CD63过表达）所致，该过程可能同时启动FcεRⅠ受体内化进程致其大量降解［23，25］，从而导致外周循环中嗜碱性粒细胞FcεRⅠ表达明显减少。

本研究因患者意愿、资金、人力等因素的制约未对对照组嗜碱性粒细胞进行检测，因此不能完全排除抗组胺药对FcεRⅠ及CD63表达的影响。然而国外的一项针对奥马珠单抗的随机双盲安慰剂对照临床试验［26］证实，单纯抗组胺药（即使在4倍常规剂量下）并不明显影响难治性CSU嗜碱性粒细胞FcεRⅠ及CD63表达。尽管有理由相信对嗜碱性粒细胞FcεRⅠ及CD63表达的抑制主要是由AWBI所致而非抗组胺药，还需要进一步研究来验证。

综上所述，本研究证实AWBI治疗ASST阳性难治性CSU患者安全有效，并发现AWBI治疗或许可导致嗜碱性粒细胞FcεRⅠ及CD63表达显著下降，提示其治疗机制可能涉及嗜碱性粒细胞FcεRⅠ介导的相关通路，为深入探讨AWBI治疗机制奠定了基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突