黑果枸杞原花青素对小鼠皮肤衰老模型的保护作用研究

马嘉艺，郭砚，冶娟，马文宇

随着医学的发展，人类的平均寿命不断增长，皮肤衰老问题得到人们越来越多的关注。皮肤衰老是一种不可避免的生理变化过程，随着年龄增长，皮肤角质形成细胞、成纤维细胞数量减少及功能下降，弹性蛋白和胶原蛋白合成减少及萎缩，皮肤变得缺乏弹性、松弛、粗糙，并伴有不规则色素沉着、皱纹等［1］。与此同时，人们对自然来源的抗氧化剂的需求也越来越多。黑果枸杞为茄科枸杞属多年生灌木，是一种独特的药食两用植物，在藏药中称为“旁玛”［2］。研究证实，黑果枸杞果实中含有大量花色苷、原花青素、多糖、黄酮等生理活性成分，具有抗氧化、抗疲劳、延缓衰老、降血糖、降血脂、预防动脉粥样硬化、增强免疫功能等作用［3］。分光光度法测得黑果枸杞的原花青素含量为16 μg/g，是蓝莓的18倍［4］。目前国内外对黑果枸杞的研究多集中于其常见生理活性成分的提取、纯化、结构分析及含量测定，尚未见对青海黑果枸杞原花青素抗衰老作用的研究。本文旨在从小鼠背部皮肤模型真皮层厚度、胶原纤维、弹力纤维及基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9方面研究黑果枸杞原花青素对小鼠皮肤衰老模型的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器 青海黑果枸杞原花青素粉末购自西安万方生物科技有限公司；维生素E滴剂及D-半乳糖粉末购自北京索莱宝科技有限公司；长波黑斑效应紫外线（UVA）+中波红斑效应紫外线（UVB）紫外线光疗仪购自南京卡知电子科技有限公司；UVB和UVA型UV辐照度监视器购自台湾路昌电子企业公司；HE染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；Weigert弹力纤维染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；IX71型Olympus倒置显微镜购自Olympus公司；Trizol RNA提取液购自ambion公司；小鼠MMP-2、MMP-9、内参β-actin的PCR引物购自华大基因公司；RT-PCR试剂盒及SYBR Green I嵌合荧光定量PCR 扩增试剂盒购自TaKaRa公司。

1.2 动物分组 2016年10月—2017年12月，选取45日龄SPF级昆明种雌性小鼠50只，体质量18～22 g，由西安交通大学动物实验室提供，标准饲料饲养。采用随机数字表法分为正常组（A组）、皮肤衰老模型组（B组）、皮肤衰老模型+维生素E滴剂组（C组）、皮肤衰老模型+低剂量黑果枸杞原花青素（D组）、皮肤衰老模型+高剂量黑果枸杞原花青素（E组），每组10只。

1.3 造模、给药方法

1.3.1 造模 A组小鼠正常光照饲养。B组、C组、D组、E组小鼠采用4%硫酸钠脱毛，脱毛区域为背部皮肤5 cm×5 cm，间隔10 d脱毛1次，每日颈背部皮下注射5% D-半乳糖10 ml/kg。B组、C组、D组、E组采用UVA+UVB紫外线光疗仪于距小鼠约40 cm垂直高处照射，功率均40 W，隔日照射，照射前灯管预热15 min，每次照射40 min，持续造模40 d（UVA总剂量89.4 J/cm2，UVB总剂量8.3 J/cm2）。造模成功的宏观体貌的观察指标为肉眼观察B组、C组、D组、E组较A组小鼠背部皮肤光滑程度减低，皱纹增多等。

1.3.2 给药方法 造模第11天，A组、B组给予0.9%氯化钠溶液灌胃0.5 ml/d，C组给予维生素E滴剂灌胃0.5 ml/d，D组、E组给予黑果枸杞原花青素灌胃，剂量分别为50 mg·kg-1·d-1和 100 mg·kg-1·d-1，连续用药 30 d。

1.4 取材 造模第42天，5组小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，快速剪取颈背部4 cm×4 cm大小的脱毛皮肤，仔细除去皮下多余脂肪，部分皮肤小心摊平后，放入10%甲醛溶液中固定用于病理组织学检测，余皮肤冷冻于-80 ℃冰箱内保存。

1.5 实验方法

1.5.1 Weigert弹力纤维染色 标本于10%甲醛溶液中固定12 h后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，进行Weigert弹力纤维染色。在光镜（×40）下观察各组标本真皮层厚度变化，在光镜（×400）下观察各组标本真皮层胶原纤维、弹力纤维的变化。

1.5.2 RT-PCR法测定MMP-2、MMP-9的mRNA表达水平 取保存在-80 ℃冰箱中的皮肤组织50 mg，提取样本皮肤组织的总RNA，测定浓度并定量后采用RT-PCR试剂盒完成反转录。取反转录后cDNA使用SYBR Green I嵌合荧光法进行PCR检测。引物设计：内参β-actin上游引物为5'-GAGTACAACCTTCTTGCAGCTC-3'，下游引物为5'-CATACCCACCATCACACCCTG-3'， 扩 增 长 度 198 bp；MMP-2上游引物为5'-TGGCACCACCGAGGACTATGAC-3'，下游引物为5'-ACACCACACCTTGCCATCGTTG-3'，扩增长度175 bp；MMP-9上游引物为5'-TGATTGACGACGCCTTTGCC-3'，下游引物为5'-CCGCGACACCAAACTGGATG-3'，扩增长度114 bp。采用2-ΔΔCt法计算MMP-2、MMP-9的mRNA表达水平。

1.6 统计学方法 应用SPSS 24.0统计软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Weigert弹力纤维染色 光镜（×40）下，肉眼可见B组较A组真皮层厚度明显减小，C组、D组、E组较A组真皮层厚度稍增厚（见图1）。光镜（×400）下，肉眼可见B组较A组真皮层胶原纤维及弹力纤维缺失、排列紊乱、结构松散，出现断裂、卷曲，证明本次小鼠皮肤衰老模型造模成功；C组较B组可见纤维组织增多、网状排列，仍可见断裂、卷曲；D组、E组较B组、C组明显可见新生纤维组织、排列整齐，断裂、卷曲明显减少，且E组较D组新生纤维更成熟（见图2）。

2.2 MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表 达 水 平 5组 小 鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。B组小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达水平高于A组，D组、E组小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达水平均低于B组，E组小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达水平低于D组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 5组小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达水平比较（±s）Table 1 Comparison of expression levels of MMP-2 mRNA and MMP-9 mRNA in 5 groups

表1 5组小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达水平比较（±s）Table 1 Comparison of expression levels of MMP-2 mRNA and MMP-9 mRNA in 5 groups

注：与A组比较，aP＜0.05；与B组比较，bP＜0.05；与D组比较，cP＜0.05

组别 只数 MMP-2 mRNA MMP-9 mRNA A组 10 0.56±0.10 0.42±0.11 B组 10 1.00±0.00a 1.00±0.00a C组 10 0.95±0.13 0.94±0.07 D组 10 0.76±0.08b 0.74±0.08b E组 10 0.52±0.06bc 0.48±0.12bc F值 13.703 17.697 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

皮肤衰老通常分为内源性衰老和外源性老化。内源性衰老又称为时程性老化或自然衰老，是具有年龄依赖性的皮肤功能和结构的老化。外源性老化又称为皮肤光老化，紫外线照射是其最主要因素，其特征更主要在于胶原、弹性纤维的损伤及异常弹性纤维的沉积等［5］。青海所在的青藏高原地区具有高海拔、缺氧、强紫外线的环境特点，长期居住于此的人群更易加速皮肤衰老，引发多种皮肤疾病。尤其高原地区强紫外线辐射对皮肤造成晒伤、炎症、抵抗力下降、氧化应激、过早衰老、癌症等伤害［6］。但与此同时，青海地区因其独特的生态环境孕育着其特有的植被资源。从天然植物中寻找高效、无害的天然抗老化成分已日渐成为学者们的研究热点。原花青素被认为是有效的抗氧化剂，其营养及生物活性价值已得到国内外学者的广泛认可［7］。但目前，青海黑果枸杞原花青素对皮肤衰老的影响机制不详。

图1 Weigert弹力纤维染色显示各组小鼠皮肤真皮层厚度的变化（Weigert弹力纤维染色，×40）Figure 1 Weigert elastic fiber staining showed changes in dermal thickness of mice skin in each group图2 Weigert弹力纤维染色显示各组小鼠皮肤真皮层纤维组织的变化（Weigert弹力纤维染色，×400）Figure 2 Weigert elastic fiber staining showed the changes of dermal fibrous tissues of mice in each group

本实验小鼠皮肤衰老模型的建立通过采用D-半乳糖皮下注射联合紫外线UVA、UVB照射，最大限度地模拟皮肤衰老过程。实验结果显示，B组较A组明显可见皮肤真皮层厚度减小，胶原纤维及弹性纤维缺失、排列紊乱、结构松散、断裂、卷曲等皮肤衰老现象，故实验造模有效。Weigert弹力纤维染色可见，经维生素E滴剂治疗后，真、表皮层变化不明显，而50 mg·kg-1·d-1和100 mg·kg-1·d-1黑果枸杞原花青素均可减少皮肤真皮纤维变性、缺失，增加真皮层厚度，后者改变程度大于前者，证实黑果枸杞原花青素对于真皮层厚度、胶原纤维及弹性纤维再生的疗效。

胶原蛋白及弹性蛋白是存在于细胞外基质（ECM）中维持皮肤弹性和强度的主要物质［8］。而MMP是一组广泛存在的Zn2+依赖性内肽酶，MMPs 能降解绝大部分ECM成分，包括胶原蛋白和弹性蛋白，对ECM成分的动态重塑起着重要的作用［6，9-10］。同时，MMP被认为是光老化的参与因子，即使极低的紫外线辐射水平也能上调人体皮肤中的MMP活性［5］。因此，抑制剂直接抑制MMP的活性或通过减少MMP的表达来间接抑制可能是抵抗皮肤衰老的有效方法。MMP根据作用底物及结构的不同分为五大类：胶原酶、明胶酶、基质溶解素、膜型MMP、其他类型MMP［6］。其中，MMP-2及MMP-9均属于明胶酶，通过降解ECM如变性胶原、基底膜结构等来影响皮肤表、真皮层导致皮肤老化［11-12］。

本实验结果显示，B组小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达水平高于A组，表明本实验的小鼠皮肤衰老模型中存在MMP的过度表达，造成细胞外基质的过度降解，从而导致皮肤衰老。D组、E组小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达水平均低于B组，E组小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达水平低于D组，进一步证实了疗效同药物有关，表明黑果枸杞原花青素可以通过较少MMP-2、MMP-9的过度表达来减少细胞外基质的过度降解，从而发挥抵抗皮肤衰老的效果。

综上所述，黑果枸杞原花青素是通过影响皮肤真皮层厚度、纤维形态及MMP-2、MMP-9水平起到治疗皮肤衰老的作用，从而证实青海黑果枸杞原花青素改善皮肤衰老的潜能，为青海黑果枸杞的开发、利用提供理论依据。