HPLC法测定桂枝红花颗粒(Ⅰ)中羟基红花黄色素A的含量

杨金颖，孙芳芳，崔学刚，张伟国

(天津市武清区中医医院，天津 301700)

桂枝红花颗粒(Ⅰ)是天津市武清区中医医院的院内制剂，主要用于治疗雷诺氏症、寒冷性多形性红斑、冻疮等症。桂枝红花颗粒(Ⅰ)主要功效是温阳祛寒，活血化瘀，由桂枝、当归、红花等药物组成。方中桂枝发散风寒，温助阳气；当归、红花辛行温通，活血通脉，共为君药。

羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A, HSYA)是红花中活血化瘀的主要成分，也是最有效的水溶性成分。现代药理学研究表明[1，2]，羟基红花黄色素A具有抗脑缺血损伤、抗氧化、抗炎、抗心肌损伤、影响血小板的活性、抗肿瘤等作用。桂枝红花颗粒(Ⅰ)的质量标准中含量测定部分空缺，本文采用高效液相色谱法建立羟基红花黄色素A的含量测定方法，以完善其质量标准。该方法简便准确，专属性强，重复性好，可用于该制剂的质量控制。

1 仪器与试药

1.1仪器 岛津LC-2010CHT高效液相色谱仪，色谱柱：Ultimate C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；BT25S型电子天平 (十万分之一)；BSA224S型电子天平(万分之一)。

1.2试药 羟基红花黄色素A对照品(批号111637-201609，含量以91.9%计)，购自中国食品药品检定研究院。桂枝红花颗粒(Ⅰ)(天津市武清区中医医院院内制剂，10 g/袋，批号20180720、20180721、20180722)。甲醇(色谱纯，honeywell)、乙腈(色谱纯，honeywell)、磷酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 Ultimate C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，检测波长为403 nm，柱温30 ℃，流速：1.0 ml/min，流动相为甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液(24∶2∶74)，进样量10 μl。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3 000。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 称取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，置于50 ml量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀，得储备液；取7 ml储备液置25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得1 ml含羟基红花黄色素A 54.81 μg的对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 取桂枝红花颗粒(Ⅰ)样品，约2 g，精密称定，加入25%甲醇50 ml，称定重量，超声40 min(超声时加入冰袋)，放冷，再称定重量，加25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性样品溶液的制备 按处方及工艺制备缺红花药材的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液。

2.3专属性试验 分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果供试品溶液和对照品溶液在相同位置均有色谱峰存在，而阴性样品溶液在此位置没有相应的色谱峰，表明在该方法下样品分离度好，阴性样品对测定无干扰。色谱图见图1。

2.4线性关系考查 称取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，置于100 ml量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀，得储备液，再分别稀释制成浓度为5.87、11.74、27.40、54.81、78.30和117.45 μg/ml的溶液。按“2.1”项下色谱条件进样检测分析，以羟基红花黄色素A的峰面积值为纵坐标(Y)，对照品浓度(μg/ml)为横坐标(X)，绘制标准曲线，得羟基红花黄色素A回归方程为Y=32 116X-1 762.5(r=1.000 0)，线性范围为5.87～117.45 μg/ml。

1.羟基红花黄色素A图1 对照品(A)供试品(B)缺红花阴性样品(C)HPLC色谱图

2.5精密度试验 取桂枝红花颗粒(Ⅰ)(批号20180721)，按照“2.2.2”项下方法制备供试液，重复进样6次，记录羟基红花黄色素A峰面积，计算RSD值为0.17 %，表明仪器精密度良好。

2.6稳定性试验 取桂枝红花颗粒(Ⅰ)(批号20180721)，按照“2.2.2”项下方法制备供试液，精密吸取同一份样品溶液，分别在0、2、4、8、12和24 h进样，记录羟基红花黄色素A峰面积，计算RSD值为0.35%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.7样品重复性试验 取桂枝红花颗粒(Ⅰ)(批号20180721)6 份，每份约2 g，按照“2.2.2”项下方法制备供试液，分别进样，记录羟基红花黄色素A峰面积，计算RSD值为0.79%，表明方法重复性较好。

2.8加样回收率试验 取桂枝红花颗粒(Ⅰ)(批号20180721)研细，精密称取 6 份，每份约1 g，均精密加入一定量的对照品溶液，分别按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录羟基红花黄色素A峰面积，计算回收率，结果羟基红花黄色素A的平均回收率为99.88%，RSD为1.41%。见表1。

2.9样品测定结果 取3个不同批号的样品，按照“2.2.2”项下方法制备供试液，分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算每袋样品中羟基红花黄色素A的含量。结果见表2。

表1 羟基红花黄色素A加样回收率试验结果(n=6)

表2 3批样品含量测定结果

3 讨论

3.1提取溶媒及时间的考查 在供试品溶液制备方法中，提取溶媒曾使用10%甲醇、25%甲醇、50%甲醇、20%乙醇和50%乙醇，比较后用25%甲醇最宜。研究中还对提取时间进行了考查，分别超声提取20、30、40和60 min，结果表明40 min为最佳。

3.2流动相的选择 本试验分别考查甲醇-0.4%磷酸水溶液、甲醇-乙腈-0.7%磷酸水溶液、甲醇-乙腈-0.4%磷酸水溶液对色谱峰的分离能力，也考查过不同的比例，结果表明采用甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液 (24∶2∶74)进行洗脱，可以将羟基红花黄色素A较好地分离。

3.3色谱柱的选择 本试验分别考查了Ultimate C18色谱柱、WondaSil C18色谱柱、Agilent C18色谱柱和Phenomenex C18色谱柱对色谱峰的分离能力，结果表明采用Ultimate C18色谱柱效果最好。

综上所述，本试验建立了桂枝红花颗粒(Ⅰ)中羟基红花黄色素A的含量测定方法，以完善桂枝红花颗粒(Ⅰ)的质量标准，参考了《中国药典》中红花的含量测定方法，在此色谱条件下该成分分离度较好，基线平稳，阴性无干扰，该方法简便准确，快速易行，稳定性好，可操作性强。